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人参AGO1基因的克隆及序列分析
目的:从人参叶片中克隆Argonaute 1 (PgAGO1)的全长基因,并利用生物信息学方法进行分析.方法:根据人参EST序列设计特异性引物,采用RACE方法克隆PgAGO1的cDNA全长,并对PgAGO1蛋白的结构进行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析；同时采用实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平.结果:克隆的PgAGO1全长cDNA为3776bp,其中包括5′UTR 204 bp,3′UTR 254 bp,基因内部包含完整的开放阅读框,可编码1105个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为122.22kDa,理论等电点pi9.71;实时定量PCR检测结果表明PgAGO1基因在人参花中的表达量高,在根中低.结论:从人参叶片中克隆得到PgAGO1的全长cDNA,为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础.
关键词： 人参 microRNA Argonaute 1 RACE 生物信息分析 -
穿心莲八氢番茄红素脱氢酶ApPDS的基因克隆及功能鉴定
采用RT-PCR和RACE技术从穿心莲植株中克隆得到了八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的全长cDNA,预测有一个l 752bp的完整开放阅读框(序列已登录GenBank,登录号KP982892),编码584个氨基酸.序列同源性分析,穿心莲PDS编码的氨基酸序列与芝麻、广藿香、黄芩等其他植物的PDS有很高的同源性,该蛋白包含一个共有的氨基酸脱氢酶的辅酶结构域NAD(H)-binding domain.利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析,发现PDS基因在穿心莲的根、茎、叶、花中均有表达,表达量为叶＞花＞茎＞根.用病毒诱导基因沉默(VIGS)的方法在穿心功莲体内鉴定ApPDS的功能,构建VIGS载体pTRV2-PDS,经农杆菌浸染穿心莲叶片,植物表型观察、定量RT-PCR检测ApPDS基因的表达,结果观察到叶片轻微变黄和明显的基因下调,鉴定了ApPDS在体内的功能.该研究首次克隆并鉴定了穿心莲PDS基因,为进一步研究穿心莲中新基因尤其是穿心莲内酯类二萜生物合成基因的功能奠定了基础.
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乌拉尔甘草HMGR基因cDNA的克隆与序列分析
目的:对乌拉尔甘草3.羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR)的cDNA克隆并进行序列分析.方法:根据NCBI数据库中的豆科其他物种HMGR的cDNA保守区设计引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从甘草根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开发阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Clustal x比对已有HMGR的氨基酸序列,并构建进化树.结果:得到1个全长为1 842 bp的HMGR的cDNA序列,含有1 722 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码573个氨基酸,具有HMGR家族的特异序列,推测的氨基酸序列与豌豆、蒺藜苜蓿的氨基酸序列一致性分别为84%,76%.结论:对甘草HMGR基因的cDNA进行了克隆,为进一步研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A在甘草酸生物合成途径中的作用提供了理论依据.
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灯盏花黄酮合成酶Ⅱ基因克隆及其生物信息学分析
目的:灯盏花Erigeron breviscapus为菊科飞蓬属多年生植物,是云南省具发展潜力的药用植物之一,灯盏乙素(scutellarin)是其主要药用成分之一.目前对灯盏乙素的生物合成途径尚缺乏了解.方法:该研究利用RT-PCR,3′-Race和5′-Race克隆得到了灯盏花黄酮合成酶Ⅱ基因(FSⅡ)的cDNA全长序列.结果:灯盏花灯FSⅡcDNA大开放阅读框(ORF)长1557bp,编码518个氨基酸残基,定名为EbFSⅡ.Blastp发现,EbFSⅡ与绿毛山柳菊Hieracium pilosella,Cynara cardunculus var.scolymus,翠菊Callistephus chinensis,非洲菊Gerbera hybrid cultivar,大丽花Dahlia pinnata和六倍利Lobelia erinus等FSⅡ的同源性高,大一致性为72％～84％.结论:与已报道的植物CYP93B亚家族构建进化树发现,灯盏花EbFSⅡ与直接催化黄烷酮转化为黄酮的CYP93B成员聚合在一起,因此可以推断灯盏花EbFSⅡ也具有相似的功能.
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猪水泡病病毒HK'1/70株基因组全长cDNA的构建及其序列测定
从实验感染猪水泡病病毒(SVDV)的乳鼠组织中提取RNA,利用长距离的RACE技术,扩增出覆盖SVDV HK'1/70株全基因组的2个忠实性的cDNA重叠片段(3'PCR片段和5'PCR片段),分别克隆进pGEM-T Easy载体.利用AatⅡ和BssHⅡ酶切含5'PCR片段的重组质粒,回收目的片段,定向克隆于含3'PCR片段的重组质粒,构建出了SVDV HK'1/70株全长cDNA重组质粒,然后进行序列测定.结果表明,HK'1/70株基因组全基因组序列长7 401 nt(poly A除外),其中5'NCR长743 nt,该毒株蛋白编码区的核苷酸序列为6 558 nt,编码一个长2 185个氨基酸的聚合蛋白,3'NCR长102 nt,其后是至少含有74个A碱基的poly A尾.在HK'1/70株全长cDNA序列的5'端引入了T7启动子序列,在poly A 3'端引入了Psp1406Ⅰ识别序列.通过序列同源性和进化树分析,结果表明,HK'1/70属于第Ⅱ抗原遗传群,SVDV与CB5的遗传关系近,且位于CB5遗传进化树的分支上.HK'1/70株全长cDNA的序列测定及构建,为拯救SVDV和在分子水平进一步深入研究SVDV打下坚实的基础.
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胃癌及其癌前病变相关新基因GP1的克隆
目的 比较胃癌、癌前病变和正常胃黏膜之间基因表达的差异,寻找与胃癌发生、发展相关的基因.方法 用荧光mRNA差异显示技术(FDD)分离差异表达的基因片段,进行PCR再扩增.将扩增的cDNA片段克隆后进行测序,测序结果提交GenBank,经BLAST检索进行同源性分析.差异条带经Northem杂交验证.应用SMART-RACE技术扩增GP1的全长cDNA,并应用生物信息学技术预测该基因的生物学功能.结果 发现1个在胃癌及癌前病变组织中低表达的而且在GenBank数据库中未找到同源序列的cDNA片段,为新的基因片段,GenBank号CD454989.GP1的全长cDNA序列为1362 bp,编码生物学功能未明的具有267氨基酸的蛋白质BAA91562.1.结论 发现了一个在胃癌、癌前病变及正常胃黏膜组织中差异表达的新基因,它可能与胃癌相关.
关键词： 胃癌 癌前病变 mRNA差异显示 Northern杂交 RACE -
应用改进的SSP-抑制PCR技术扩增cDNA片段旁侧序列
结合抑制PCR和单链特异引物PCR技术,降低RACE过程中由公用引物引发的非特异扩增、增加目的cDNA在原始模板中的相对比例,从而提高RACE特异性,有效地扩增靶序列.
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镰形扇头蜱IgG结合蛋白基因的克隆与表达分析
本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,应用RACE方法从镰形扇头蜱体内克隆出一个IgG(IgG binding protein,IGBP)基因的全长序列,该基因全长683bp,编码178个氨基酸,预测分子量为19.5 kDa,经同源性比较该基因与具尾扇头蜱的IGBP-MB基因序列的同源性高达92%.用RT-PCR方法分析了该基因表达的性别特异性、各个器官、不同发育阶段的表达情况,结果表明,该基因表达没有性别特异性;IGBP基因在唾液腺、壳这2个器官有所表达,但在肠中却没有表达;在蜱的各个发育阶段均有表达.
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球形孢子丝菌vps34基因序列的获得及其在双相型表达差异的初探
目的 获得球形孢子丝菌液泡分选蛋白34(vacuolar protein sorting 34,Vps34)编码基因全长序列,并探讨vps34基因在球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)由菌丝相向酵母相转换中的作用.方法 利用快速扩增cDNA末端技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法分别扩增球形孢子丝菌vps34基因3′端和5′端序列,序列拼接后进行生物信息分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析vps34基因在菌丝相和酵母相的表达差异.结果 球形孢子丝菌vps34基因全长共3228 bp,其中CDS区长度为3000 bp,编码999个氨基酸,相对分子质量(Mr)为111.49×103,等电点为6.38,包含C2 PI3K classⅢ、PI3KaⅢ、PI3KcⅢ共3个结构域;qRT-PCR检测结果显示,24 h时,球形孢子丝菌酵母相的vps34表达量高于菌丝相(P<0.05),48 h时差异大(P<0.01).结论 vps34基因参与了球形孢子丝菌双相型转换的过程,而球形孢子丝菌vps34基因全长的获得为进一步研究Vps34p的功能提供实验资料.
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罗汉果果实RNA的提取及SgDHAR基因的克隆与表达
针对罗汉果果实富含酚类、多糖、油脂和蛋白质等特点,从3种常用的RNA提取方法中优选出改良Trizol法,应用该法得到的RNA纯度高(OD260/280=2.01;OD260/230=2.02)、完整性好(RIN=9.50)、得率高(260μg·g-1).以该法提取的RNA为模板,通过RACE和RT-PCR技术克隆罗汉果脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,其长度为1 252 bp,开放阅读框(ORF)为819 bp,命名为SgDHAR,GenBank登录号为KC907731,编码一条272个氨基酸的肽链,理论分子量为30.217 7kD,等电点为8.76.该蛋白与GenBank中已登录的DHAR序列比对显示与黄瓜同源性高(87％).应用实时荧光定量PCR对SgDHAR在罗汉果不同组织及不同倍性中的表达模式分析发现,该基因主要在果实和茎中表达,其次是花,根中的表达量低;在三倍体中的表达量为二倍体的6.83倍,推测该基因可能参与了三倍体无籽罗汉果的败育过程.
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金铁锁鲨烯合酶cDNA的克隆和功能鉴定
濒危药用植物金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu.)的有效成分三萜总皂苷有显著的药理活性.为克隆和鉴定金铁锁三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因--鲨烯合酶的全长cDNA,本研究采用同源兼并引物PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了其全长cDNA;结合大肠杆菌异源表达、体外酶促反应及针对产物化学结构的GC和GC-MS分析等方法鉴定了其功能.研究结果表明:金铁锁鲨烯合酶cDNA全长为1 663 bp,含有1 245 bp的开放阅读框(ORF),编码414个氨基酸(计算分子质量为47.69 kD),5′非编码区(UTR)和3′UTR分别为260 bp和158 bp,GenBank注册号为EF585250,与三七、人参和甘草的鲨烯合酶的氨基酸序列有较高的同源性,分别为83%、 82%和82%,而与裂变酵母、白色念珠菌和人的氨基酸序列的同源性分别只有35%、 39%和47%;表达产物具有催化两分子法呢烯焦磷酸连接成鲨烯的活性.本研究克隆和鉴定了金铁锁鲨烯合酶的全长cDNA,为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要基础.
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丹参4-(5′-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的cDNA全长克隆及其诱导表达分析
本文首次从丹参毛状根中克隆得到了丹参4-(5′-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(简称为SmCMK)的编码基因的全长cDNA序列,GenBank注册号:EF534309.KEGG软件分析表明:SmCMK位于二萜类化合物生物合成的上游途径--非甲羟戊酸途径(DXP),是DXP途径上唯一的激酶.所克隆的SmCMK基因序列全长1 493 bp,包括完整的开放阅读框(open readingframe,ORF),推测编码396个氨基酸的多肽,分子质量为43.302 kDa,等电点(pI)值为6.78;含有71 bp的5′非转译区(5′ UTR)和232 bp的3′非转译区(3′ UTR).末尾具有完整的AATAA加尾信号和PolyA结构,说明所克隆基因的序列较为完整.经序列比对分析表明,SmCMK与其他植物CMK激酶家族具有较高的同源性.实时荧光定量PCR结果显示该基因受茉莉酸甲酯(MJ)诱导后表达水平显著升高,与丹参酮类成分含量受MJ诱导后的增加趋势一致,初步证明了SmCMK基因表达量与丹参酮类成分的积累之间的关系,为进一步研究丹参酮类成分的次生代谢调控机制奠定了基础.
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铁皮石斛DoLEA2基因的克隆、表达及功能分析
晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)是一种亲水、热稳定性蛋白,与植物抗逆性密切相关,研究LEA家族基因对铁皮石斛抗逆性研究具有重要意义.本研究以铁皮石斛(Dendrobium officinale)种子为材料,采用RACE技术获得全长cDNA,命名为DoLEA2 (GenBank登录号:KY626329).该基因全长cDNA为l 224 bp,编码313个氨基酸,具有晚期胚胎富集蛋白(LEA_2)结构域和水分胁迫高敏感响应结构域,所编码蛋白与其他物种LEA2蛋白具有较高相似性,在进化上与单子叶植物聚为一支,且与蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)亲缘关系近.铁皮石斛DoLEA2在叶的表达量高,根和茎次之.该基因在Escherichia coli BL21(DE3)中能够高效表达,其优化表达条件为:37℃添加终浓度0.5 mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导4h.盐胁迫条件下与对照组相比,重组pET28a-DoLEA2菌株表现出较好的耐盐性.本研究首次获得了铁皮石斛LEA2全长cDNA序列,验证了其耐盐胁迫功能,为进一步研究铁皮石斛抗逆性分子机制提供科学依据.
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香樟1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因CcDXR1的克隆和表达分析
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)是萜类甲基赤藓醇-4-磷酸途径(methylerythritol-4-phosphate pathway,DXP/MEP)上的第二个限速酶.本研究以5种化学型的香樟(Cinnamomum camphora)作为实验材料,基于转录组数据,运用快速扩增cDNA末端技术(RACE),从香樟中克隆出DXR基因的cDNA,命名为CcDXR1 (GenBank登录号:KU886266).该基因开放阅读框(ORF)长1 413 bp,编码470个氨基酸残基,生物信息学分析推测其分子质量为51.1 kD,等电点(Theoretical pI)为6.62,不含信号肽,不存在跨膜结构.结合蛋白质保守区以及进化树分析,证实该基因确为DXR家族基因.利用实时荧光定量PCR检测得出香樟中CcDXR1基因在成熟叶片表达量高于幼嫩叶片,根与叶中表达量相当,枝中低.CcDXR1在香樟5种化学型中的表达量不同,在龙脑樟中的表达量要高于油樟、芳樟、脑樟和异樟4种化学型.本研究首次从香樟中克隆出了CcDXR1序列全长,并揭示了CcDXR1在不同组织、生长时期及5种化学型中的差异表达,为香樟萜类化合物生物合成途径关键酶基因的挖掘提供研究基础.
关键词： 香樟 5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶 RACE 生物信息学 表达分析 -
新的白血病相关基因LRP16的克隆
目的:发现新的白血病相关基因及探讨白血病的发生机制.方法:应用分子克隆技术RLGS及RACE技术自急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆新的白血病相关基因.结果:克隆到一个长度为2948 bp 的DNA片段,经国际基因库同源检索证明为一未知基因的一部分,并定位于第11号染色体长臂11区,进一步克隆到这一基因的全长cDNA,其长度为980 bp,并被国际基因库以新的人类基因LRP16收录入库.结论:RLGS及RACE技术对于发现白血病相关基因是一种有效的方法,LRP16基因的发现对于探讨白血病发生机制具有一定意义.
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cDNA末端快速扩增技术及其在血液疾病上的应用
克隆新基因及获得其cDNA全长是现代生命科学中研究基因功能的重要前提.以PCR为基础的cDNA末端快速扩增(RACE)技术是一种简单、敏感且有效扩增cDNA全长的方法.该文主要概述RACE技术的原理、进展及其在血液疾病基因克隆方面的应用.
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家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2C cDNA全长的克隆
目的 克隆家族性急性髓系白血病相关新基因全长,在分子水平上探讨急性白血病发生发展的机制.方法 以构建的家族性急性髓系白血病抑制性消减性文库中1个有差异表达的新基因EST序列(zywb4)为基础,综合应用电子克隆和cDNA末端快速扩增法(RACE)技术克隆家族性急性髓系白血病相关新基因的全长cDNA.结果 获得家族性急性髓系白血病差异表达新基因ELF2C的全长cDNA和432 bp的开放阅读框(ORF),Blast检索为一功能未知基因,被GenBank收录,注册号为DQ359746.结论 成功获得一个家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2C cDNA全长,为进一步研究其功能提供了依据.
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红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析
目的 克隆红花栝楼鲨烯合酶(squalene synthase,SS)的基因并进行序列分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础.方法 根据绞股蓝与罗汉果SS基因cDNA比对分析的结果,设计SS的5'端简并引物,采用3'RACE扩增红花栝楼SS全长cDNA基因.结果 获得红花栝楼SS cDNA全长共1 466个核苷酸,其中包括一个含有1 254个核苷酸的开放读码框,编码417个氨基酸残基.通过NCBI的Blast比对,发现红花栝楼SS基因编码的氨基酸序列与已知植物SS基因编码的氨基酸序列同源性为78％～94％,核苷酸的同源性为74％～93％.结论 成功克隆了红花栝楼SS的全长cDNA,为进一步研究红花栝楼SS基因结构、基因表达、基因突变提供了基础,并为葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持.
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姜黄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析
目的 对姜黄Curcuma longa苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(CurPAL)全长进行克隆并开展生物信息学分析,为姜黄次生代谢产物的生物合成机制研究奠定基础.方法 利用RT-PCR和RACE相结合的方法,以姜黄叶片cDNA为模板,克隆获得CurPAL全长,进行生物信息学分析.结果 克隆的CurPAL(登录号为KJ780359)全长cDNA为1293bp,其中包括5'-UTR 243 bp,3'-UTR 123 bp,含有1个927bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码308个氨基酸;预测蛋白质相对分子质量为33 000,理论等电点pI为5.76; CurPAL蛋白性质稳定,为可溶性蛋白;CurPAL编码的蛋白质序列包含与夹竹桃PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点,氨基酸序列多重比较发现,CurPAL编码的氨基酸序列与中国李、浙江红山茶、拟南芥、辣椒、小果野蕉PAL氨基酸序列的同源性达到75％以上;与姜目类的植物(如小果野蕉)的PAL聚为一支,说明两者亲缘关系较近;通过蛋白质二维、三维结构的预测,表明CurPAL蛋白为全α型蛋白,由同源四聚体构成.结论 首次克隆并获得CurPAL基因全长cDNA,为姜黄素生物合成途径的阐明和改善中药材品质提供科学依据.
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红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建
目的 克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长cDNA序列,构建植物超表达载体.方法 根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS (CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长cDNA序列.采用DNA重组技术构建pBASTA-CtDHDPS植物超表达载体.结果 分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79.通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体pBASTA-CtDHDPS.结论 获得CtDHDPS基因全长cDNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据.
