首页 > 文献资料
-
红花黄酮醇合酶基因的全长cDNA克隆及植物表达载体的构建
黄酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)是黄酮化合物代谢途径中的关键酶之一.本文在红花转录组测序结果中获得中间序列的基础上,采用RT-PCR和RACE技术,从我国传统中药材红花花瓣中克隆到黄酮醇合酶基因的全长cDNA.该基因全长1 201 bp,开放阅读框1 011 bp,编码336个氨基酸.系统进化分析表明,红花FLS基因编码氨基酸与同属菊科植物氨基酸具有一定的同源性,其中与金光菊的亲缘关系近.通过分子生物学方法,成功构建pBASTA-FLS植物表达载体.为后续研究该基因的生物功能及黄酮化合物合成机制奠定了基础.
-
红花bHLH转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建
克隆红花花瓣中bHLH(basic helix-loop-helix)基因,研究其在红花不同开花时期花瓣中的表达量并构建其植物表达载体.利用红花基因组测序结果中富集到的bHLH家族中的基因CtbHLH1的开放阅读框,设计特异性引物进行PCR扩增.利用RT-PCR法分析在红花不同开花时期花瓣中bHLH1基因的表达量,同时构建植物表达载体pBASTA-bHLH1.获得bHLH1基因全长897 bp,编码298个氨基酸.红花bHLH1与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与烟草的氨基酸序列相似性高.实时荧光定量PCR分析表明,Ctb HLH1基因在红花不同组织及不同开花时期的花瓣中表达水平具有显著差异,其在花瓣中表达量高,开花第3天表达量高,末花期表达量低.另外其在根中有表达,在茎、叶中表达量极低.该研究成功地对bHLH1基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体pBASTA-bHLH1.
-
红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建
目的 克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长cDNA序列,构建植物超表达载体.方法 根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS (CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长cDNA序列.采用DNA重组技术构建pBASTA-CtDHDPS植物超表达载体.结果 分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79.通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体pBASTA-CtDHDPS.结论 获得CtDHDPS基因全长cDNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据.
-
红花bZIP20转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建
目的 克隆红花花瓣中bZIP20 (Basic region/leucine zipper motif)基因,研究其在不同组织中的表达量并构建其植物表达载体.方法 根据红花转录组测序结果挑选bZIP基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增bZIP20基因开放阅读框(ORF)片段,利用RT-PCR法分析在红花不同组织以及尖孢镰刀菌侵染后红花根部bZIP20基因的表达量,同时构建植物表达载体pBASTA-bZIP20.结果 bZIP20基因ORF长981 bp,编码326个氨基酸(GenBank登录号为KT692605).红花bZIP20与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与芝麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达85.41％和83.99％.实时荧光定量PCR分析表明,bZIP20基因在不同组织中的表达水平具有显著差异,在花中呈现高表达,而在其他组织中低表达.接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中bZIP20基因的表达显著上调.结论 成功地对bZIP20基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体pBASTA-bZIP20.
-
卡介苗D2株分泌蛋白基因植物表达载体的构建
目的克隆卡介苗(BCG)D2株32-kDa分泌蛋白基因(fbpA基因),构建重组植物表达载体pBI121-fbpA,为研制转基因植物口服疫苗奠定基础.方法采用PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离fbpA基因,构建重组克隆载体pUCm-T-fbpA,经过单菌落PCR法、BamHⅠ、SacⅠ和HindⅢ单双酶切、DNA序列分析鉴定后,将fbpA基因亚克隆入植物表达载体pBI 121,得到重组载体pBI 121-fbpA,并转化根癌农杆菌株EHA105,用PCR法对其进行鉴定.结果重组载体pUCm-T-fbpA测序后证实fbpA基因由1 041 bp组成,包括1个1 014 bp的开放阅读框.DNA序列上游由编码一段信号肽的129 bp组成,并对32-kDa蛋白的分泌起决定作用.相应的编码成熟蛋白的序列由885个碱基组成.fbpA基因与来源于BCG1173P2株的同一基因序列完全一致.此外,构建的重组植物表达载体pBI121-fbpA成功转入根癌农杆菌株EHA105.结论编码BCGD2株32-kDa分泌蛋白的fbpA基因分离成功,DNA序列分析证实fbpA基因在分枝杆菌中高度保守,为进一步深入分析fbpA基因以及研制抗结核病转基因植物疫苗奠定了基础.
-
植物细胞表达人胰岛素的载体构建
目的构建人胰岛素的植物细胞表达载体.方法设计多对引物,通过PCR反应合成霍乱毒素B亚单位(CTB)基因和不带C肽的人胰岛素基因.将霍乱毒素B亚单位(CTB)基因与这种不带C肽的人胰岛素基因融合后,插入克隆载体,然后用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ进行酶切,并将酶切的融合基因片段连接在植物表达载体pBI121上,后用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ进行酶切鉴定.结果测序结果表明,PCR扩增的目的基因顺序与设计完全一致,并构建了克隆载体和植物表达载体.植物表达载体经酶切后鉴定,所含基因片段大小与预期相符.结论已成功地构建了人胰岛素基因的植物细胞表达载体.
关键词： 人胰岛素基因 霍乱毒素B亚单位(CTB) 植物表达载体 -
拟南芥AtVQ29基因的克隆与植物表达载体构建
目的:VQ模序蛋白是植物中所特有的一类具有高度保守序列的蛋白质,广泛参与植物的生长发育与逆境反应,本研究拟克隆拟南芥的AtVQ29基因并进一步构建由组成型启动子CaMV35S驱动的植物表达载体pSN 1301-AtVQ29.方法:采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,根据已报道的AtVQ29基因序列设计并合成引物,通过PCR技术扩增获得拟南芥AtVQ29基因,经T载体克隆后测序.利用生物信息学软件对序列进行初步分析,同时基于基因重组技术构建植物表达载体.结果:序列分析表明已成功克隆AtVQ29基因,该基因编码区全长为372bp,共编码123个氨基酸残基,具有保守的VQ模序.并进一步构建了由组成型启动子CaMV35S驱动的AtVQ29基因植物表达载体pSN1301-AtVQ29.结论:本研究所构建的AtVQ29基因植物表达载体能够在转基因植株中过量表达AtVQ29基因,为后期开展基因功能研究与植物基因改良奠定了基础.
-
弓形虫多表位基因植物表达载体的构建
目的构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体.方法①将TGMG亚克隆入pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3'结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG.②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体pB35E1MG,再将其中E35SE81.1/TGMG/NOS3'结构单元亚克隆入pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35E1MG.③将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG构建中间载体pBE2MG,再将其中E82.2/TGMG/NOS3'结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pCE2MG.测序鉴定pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG中的TGMG序列.④pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG转化根癌农杆菌LBA4404.结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG测序结果正确.结论成功构建TGMG中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG,以及植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG.并将3种植物表达载体导入根癌农杆菌.
关键词： 弓形虫 多表位基因 番茄果实特异性启动子 植物表达载体 -
转基因烟草表达东亚钳蝎抗神经兴奋肽Ⅱ的研究
研究将东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)抗神经兴奋肽Ⅱ(ANEPⅡ)基因序列定向克隆到植物表达载体pBI121中,构建了植物表达载体pBI-ANEPⅡ.采用三亲交配法和液氮冻融法将重组质粒pBI-ANEPⅡ导入农杆菌中,获得了工程菌pBI-ANEPⅡ/LBA4404.通过农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草叶片外植体,在含卡那霉素的培养基上进行转化体的筛选,获得了转基因烟草.通过PCR检测、RT-PCR和Western blotting鉴定,检测结果表明ANEPⅡ蛋白在转基因烟草植株中得到表达.
关键词： 东亚钳蝎 抗神经兴奋肽ANEPⅡ 植物表达载体 烟草遗传转化 -
通用型植物GFP标签蛋白表达载体的构建和蛋白质的细胞内定位研究
目的 构建通用型植物GFP标签蛋白表达载体,研究蛋白质的细胞内定位对蛋白质组学和代谢组学等研究的意义.方法 构建2种GFP标签蛋白质表达载体,分别在GFP的N和C端预留克隆位点,以克隆目的基因.利用该基因克隆载体,分别克隆内切酶FokI的切割结构域与MS2噬菌体外壳蛋白MCP的串联蛋白(FokI:MCP:FokI,FMF)至GFP的N和C端,得到FMF与CFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP,其中FMF的N端带有细胞核定位信号.利用农杆菌介导植物瞬时表达侵染本氏烟草和洋葱表皮细胞,观察GFP荧光表达情况.结果 成功构建了2种融合了目的基因和GFP的表达载体pER35 GFP-FMF和pER35 FMF-GFP.激光共聚焦结果显示侵染了只含GFP载体的农杆菌的烟草细胞,可在细胞核和细胞质中检测到GFP的绿色荧光,而侵染了含核定位信号FMF:GFP和GFP:FMF 2种融合蛋白载体的农杆菌的烟草细胞,只在细胞核中观察到绿色荧光.结论 该载体系统可运用于研究蛋白质在植物细胞中的亚细胞定位,具有克隆简单、高效和通用性的特点.
-
抗汉坦病毒单链抗体基因向拟南芥遗传转化的初步研究
目的 构建抗汉坦病毒mAb 1A8 scFv的转基因拟南芥植株.方法 从含有1A8 scFv基因的重组质粒中酶切获得携带Nos终止子的抗体基因片段,将其与CaMV 35S启动子相连克隆入载体pCAMBIA2301,构建1A8 scFv基因的植物表达载体1A8scFv-pCAMBIA2301.通过农杆菌介导的花粉管法将其转入拟南芥,PCR及Dot blot检测是否获得转基因植株,ELISA和固相酶联斑点实验检测表达产物的生物学活性.结果 酶切鉴定结果证明1A8 scFv基因被成功克隆入植物表达载体pCAMBIA2301,构建获得1A8scFv-pCAMBIA2301重组质粒.PCR及Dot blot检测证明获得抗汉坦病毒mAb 1A8scFv的转基因拟南芥植株.ELISA和固相酶联斑点实验结果证明在转基因拟南芥中成功表达了具有生物学活性的抗汉坦病毒mAb 1A8 scFv片段.结论 成功地将外源基因转入拟南芥中并表达.为进一步研究利用植物表达医用抗体奠定了基础.
-
抗汉滩病毒鼠源单抗3G1单链抗体转化拟南芥的研究
目的运用植物转基因技术,探索构建表达抗汉滩病毒鼠源单抗3G1单链抗体基因的植物生物反应器的可能性及技术路线.方法将鼠源单抗3G1单链抗体基因连接在双元表达载体pBI121 CaMV35s启动子下游,构建了能在植物中高效表达的载体pBI121-3G1ScFv.利用根瘤农杆菌介导的抽真空转基因技术,将其转入野生拟南芥中.结果经过酶切分析、PCR验证及抗性筛选,结果表明3G1 ScFv基因被导入拟南芥组织细胞,获得9株T0代转基因植株.结论本研究为进一步培育3G1ScFv遗传表达植株奠定了基础.
-
弓形虫SAG1基因截短片段植物表达载体的构建
目的将弓形虫SAG1基因截短片段(t-SAG1),分别用植物组成型E35S启动子和番茄果实特异性E8启动子驱动,构建t-SAG1植物表达载体.方法自本室构建的pET32a-t-SAG1载体中PCR扩增得到t-SAG1基因,克隆进T载体为pMD-T-t-SAG1,酶切鉴定后进行测序确认.用BamHⅠ单酶切连接方式将t-SAG1分别亚克隆进pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG载体,分别构建中间载体pB35-t-SAG1、pB35E1-t-SAG1、pBE2-t-SAG1载体.其中,pB35-t-SAG1以E35S驱动t-SAG1,3′端携带NOS3′终止子序列,组成 E35S/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元.pB35E1-t-SAG1含E35S和番茄果实特异性E8启动子核心序列E81.1双启动子驱动t-SAG1,组成E35SE81.1/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元.pBE2 t-SAG1以番茄果实特异性E8启动子全长E82.2驱动t-SAG1,组成E82.2/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元.pB35-t-SAG1、pB35E1-t-SAG1、pBE2-t-SAG1经酶切证实后,分别将其中E35S/t-SAG1/NOS3′、E35S-E81.1/t-SAG1/NOS3′、E82.2/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元以HindⅢ单酶切连接方式亚克隆进pCAMBIA2300质粒中,构建植物表达载体pC35-t-SAG1、pC35E1-t-SAG1、pCE2-t-SAG1,酶切鉴定.含三种启动子驱动t-SAG1的植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞后, PCR鉴定农杆菌中的t-SAG1.结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期大小片段;CR鉴定转化入根癌农杆菌LBA4404的t-SAG1基因扩增得到预期700bp大小片段;pMD-T-t-SAG1测序结果表明t-SAG1基因序列完全正确,读码框正确.结论成功构建t-SAG1中间载体pB35-t- SAG1、pB35E1-t-SAG1、pBE2-t-SAG1,以及植物表达载体pC35-t-SAG1、pC35E1-t-SAG1、pCE2-t-SAG1,并将三种植物表达载体成功导入根癌农杆菌,为弓形虫转基因番茄口服疫苗的研究奠定了基础.
关键词： 刚地弓形虫 SAG1基因截短片段 番茄果实特异性启动子 植物表达载体 -
变形链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合基因植物表达质粒的构建及转化烟草研究
目的 构建含变链菌乳酸脱氢酶(LDH)和霍乱毒素B亚单位(CTB)嵌合基因的植物表达质粒并以根癌农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草.方法 应用PCR技术扩增嵌合基因,并与植物中间表达载体p2355双酶切连接,构建植物表达载体p2355-ldh-ctxB,电击法导入根癌农杆菌EHA105,根癌农杆菌叶盘转化法转化烟草,对抗性植株进行PCR、GUS组织染色、RT-PCR检测.结果 载体p2355-ldh-ctxB经双酶切及PCR证实均能得到与预期相符的片段,农杆菌介导转化烟草得到的抗性植株GUS组织染色呈阳性,PCR扩增nptⅡ基因和目的 基因部分片段,均获得了与预计相符的片段,部分样品RT-PCR能扩增出与预期一致的片段.结论 成功构建植物表达质粒p2355-ldh-ctxB,经根癌农杆菌介导转化烟草后获得了转基因烟草植株.
-
CMV甜瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建
从河南省临颖县采集的病毒感染的甜瓜样本经ELISA检测和接种分离获得黄瓜花叶病毒(Cucunber mosaic virus ,CMV) 分离物.把该分离物接种西葫芦, 从发病的叶片中提取总RNA,并以此为模板经RT-PCR扩增获得CMV的外壳蛋白(cp)基因,将其克隆到pUCm-T质粒上.经序列测定和分析,结果表明该cp基因由657个核苷酸组成,编码218个氨基酸.其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物有较高的同源性,达92.2%～93.9%,与亚组II的同源性仅为76.8%～77.8%,与我国报道的CMV分离物的cp基因序列比较,除香蕉株系XB外核苷酸序列的同源性达91.8%～93.4%.根据这些分析,该CMV分离物属于亚组I.将cp基因通过中间载体pJIT163定向克隆到植物表达载体pBINPLUS中(重组双元载体质粒命名为pBCP),并经冻融法导入农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.利用该植物表达载体对西瓜的遗传转化工作目前正在进行中.
-
果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建
目的构建果实特异性启动子驱动的含编码变形链球菌唾液粘附区( sbr)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达,为研制有效的转基因植物防龋疫苗打下基础.方法提取番茄基因 DNA,利用 PCR 技术扩增果实特异性启动子 E8和 2A11基因,双酶切质粒 PROP及 PROSC,分别与目的基因连接, 构建重组植物表达载体.结果通过双酶切鉴定,目的基因片段已正确整合到植物表达载体中.结论本实验成功构建了果实特异性启动子驱动的含 sbr基因的植物表达载体.
关键词： 果实特异性启动子 E8 2A11 变形链球菌唾液粘附区 植物表达载体 -
编码霍乱肠毒素B亚单位基因植物表达载体的构建
目的构建含霍乱肠毒素B亚单位(CTB)基因的植物双元表达载体.方法采用高保真PCR方法调出CTB基因,定向克隆到中间载体pRTL2,经测序证实核酸序列正确后,再亚克隆到含植物双元表达载体pBI121上;采用电击法,将含CTB的植物表达载体转入根癌农杆菌中,并进行酶切证实.结果PCR扩增的CTB片断亚克隆到中间载体,得到pRCTB和pRCTBK,测序证实CTB核酸序列正确;再与根癌农杆菌双元载体pBI121连接,获得含CTB基因的植物双元表达载体pBI-CTB和pBI-CTBK,转入根癌农杆菌的载体,酶切证实正确.结论采用正确技术路线,构建了含CTB基因的植物表达载体,为下一步的转基因植物表达研究打下了坚实的基础.
-
白藜芦醇合酶基因的克隆与植物表达载体的构建
目的 为获得含有白藜芦醇(Res)的转基因植物,进行了白藜芦醇合酶(RS)基因的克隆、植物表达载体构建的研究.方法 以葡萄为材料,从其叶片中提取基因组DNA,并以此DNA为模板,利用PCR法扩增得到RS基因,将此基因连接到克隆载体PGEM-T Vector,得到重组载体pT-RS;经酶切及测序鉴定后,将RS基因克隆到植物表达载体pB1121,得到重组载体pBI-RS,用PCR及酶切方法进行鉴定.结果 重组质粒pT-RS的测序结果表明,RS基因的片段大小为1.522 kb.将此片段正向插入植物表达载体pB1121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行PCR及酶切鉴定,均得到预期大小的片断,证明RS DNA与质粒pB1121已成功连接,植物表达载体pBI-RS构建正确.结论 成功扩增得到RS基因及成功构植物表达载体pBI-RS,为RS转基因生菜的研究奠定了基础.
-
日本血吸虫 Mr=26×103谷胱甘肽S-转移酶基因植物表达载体的构建
[目的]构建日本血吸虫 Mr=26× 103谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)基因的植物表达载体,为研制血吸虫病口服疫苗做前期准备.[方法]采用 PCR技术,扩增目的基因 GST,与植物表达载体 pBI 121连结,构建重组表达载体 pBI 121-GST.[结果]通过 PCR检测和双酶切鉴定以及重组质粒序列测定,结果表明,该目的基因片段已被整合到植物表达载体 pBI 121中,通过电激转化,将质粒转入农杆菌菌株 LBA4404、 EHA105中.[结论]本实验成功地构建了日本血吸虫 Mr=26× 103谷胱甘肽 S 转移酶 GST基因的植物表达载体.
关键词： 日本血吸虫 谷胱甘肽 S 转移酶基因 植物表达载体 -
变异链球菌表面蛋白PAc基因A区与霍乱毒素B亚单位融合基因植物表达载体的构建
目的 构建变异链球菌表面蛋白PAc A区与霍乱毒素B亚单位的植物表达载体,为可食嵌合体防龋疫苗的进一步研究提供实验基础.方法从中间载体pBPC55获得含35s启动子、NOS终止子和多克隆位点的片段,定向连接到植物双元表达载体pCAMBIA2301上,构建重组载体p2355;通过PCR扩增从重组质粒pEAC 10中获得表面蛋白PAcA区与霍乱毒素B亚单位的融合基因pacA-ctxB,克隆至重组质粒p2355中,构建植物表达载体p2355-PAcA/CTB,电转化法导入根癌农杆菌EHA105.PCR及酶切鉴定.结果PCR扩增得到了含35s启动子、NOS终止子和多克隆位点的1.1kb大小片段,经酶切鉴定,该片段已经插入到植物双元载体pCAMBIA2301中.PCR扩增得到了pacA-ctxB基因:构建的质粒p2355-PAcA/CTB经Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切及PCR检测,均得到1.7kb大小的片段,与预计的嵌合目的基因片段大小相同.结论成功构建pacA-ctxB融合基因的植物表达载体p2355-PAcA/CTB.
