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北柴胡UGT基因的克隆及其过量表达和RNAi转基因载体的构建
目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的UGT基因,构建其过表达和抑制表达的转基因载体,为通过转基因验证其功能奠定基础.方法:在454高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过RACE和LD-PCR方法扩增全长cDNA克隆.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增UGT基因的ORF和部分片段后,酶切,分别插入到pCAMBIA-SUPER1 300和pHANNIBAL中.重组的pHANNIBAL经Not(I)酶切后插入到pART27中.终以构建出过表达和抑制表达的转基因载体.结果:扩增到了北柴胡1个UGT基因全长cDNA克隆,构建了这一基因的过表达和抑制表达转基因载体.结论:通过UGT基因的全长cDNA克隆和转基因载体构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础.
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针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体的构建及功能鉴定
目的 设计构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,以用于制备相关转基因小鼠,并在体外验证其有效性.方法 剔除pcDNA3.1载体的CMV启动予以及多克隆位点,然后接入带有LacZ-fLoxP插入失活的小鼠U6启动子并引入适当的酶切位点,装入设计好的shRNA片段,测试shRNA抑制Chmp1b表达的效率与专一性,检查Cre重组酶介导位点特异性重组去除LoxP位点之间的lac基因后U6启动子活性恢复情况.结果 设计的shRNA片段可明显降低Chmp1b的表达,抑制效率达90％以上;成功构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,插入U6启动子中的LacZ-fLoxP片段既可以控制U6启动子活性又可以起到报告基因的作用.结论 针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体可以用于制备相关转基因小鼠.
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两种转基因载体对关节软骨细胞中内参基因转录水平的影响
目的 探讨质粒型和腺相关病毒两种转基因载体对家兔关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB内参基因mRNA转录水平的影响.方法 将携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EFGP)报告基因的质粒型载体pcDNA6.2-EGFP和腺相关病毒载体AAV2-EGFP分别转染至体外培养的家兔关节软骨细胞中,荧光显微镜观测转染后关节软骨细胞中EGFP的表达,实时PCR技术检测两各组关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB基因mRNA转录水平的变化.结果 转染48 h后,两组转基因关节软骨细胞中均可见明显的绿色荧光;与正常对照组相比,4个内参基因在两组转基因细胞内的转录水平均下调,其中GAPDH和TUBB基因下调较小,腺相关病毒载体对转基因的影响小.结论 腺相关病毒载体对关节软骨细胞中内参基因表达的影响低于质粒型载体,表明腺相关病毒对关节软骨细胞本身影响较小;GAPDH和TUBB基因可作为实验的内参基因校正目的基因的表达量.
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时空调控 miR-195敲减转基因载体的构建及验证
目的：构建时空调控 miR-195敲减转基因载体并验证其活性。方法通过分子克隆技术构建含有神经特异性启动子、四环素诱导表达系统、miR-195海绵、绿色荧光蛋白及绝缘子等调控元件的转基因载体并测序鉴定，利用细胞转染技术将该载体瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞，经荧光显微镜观察其荧光表达，利用实时定量 PCR 技术及蛋白免疫印迹检测miR-195含量及 GFP 蛋白表达。结果通过将 Tet-on 四环素诱导系统中反义转录激活子 rt-TA 克隆到 NSE 启动子下游，以及 TRE-Tight 的多克隆位点内引入 miR-195海绵携带 IRES 介导的 EGFP ，获得双质粒 Tet-on 表达载体。以 pcDNA 3.1＋质粒为骨架，3个不同区域的双拷贝 cHs 4绝缘子核心片段为间隔，将其调控元件（ NSE-rtTA ）和反应元件（ TRE-miR-195 sponge-IRES-EGFP ）串联成单一转基因载体。该载体经测序验证序列正确，瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞，经强力霉素诱导36 h 后细胞内可见明显绿色荧光蛋白表达，且 miR-195表达水平明显降低。结论成功构建神经系统特异性 miR-195敲减转基因载体，并具有时空调控的特点，为进一步建立转基因动物模型奠定基础。
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肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10转基因载体的构建和鉴定
目的 构建小鼠肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10的转基因载体pALB-PEG10-EGFP,为制备转基因小鼠做准备.方法 RT-PCR扩增PEG10基因cDNA序列,克隆人T载体进行酶切、测序鉴定,后将其定向克降至真核表达载体pALB-EGFP中ALB的下游,构建转基因载体pALB-PEG10-EGFP;在Lipofectamine介导下转染LO2细胞,经G418抗性筛选,挑选阳性克隆并扩大培养;采用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法分析PEG10在LO2细胞中的表达和细胞内定位.结果 酶切和测序结果表明pALB-PEG10-EGFP构建成功;稳定转染后的LO2表达有PEG10的mRNA及蛋白,且主要定位于胞浆.结论 重组体pALB-PEG10-EGFP的构建初步奠定了转基因小鼠制备的基础.
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三种EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因载体的构建
为制备EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因转基因小鼠,探讨LMP的体内致瘤作用,本文构建了三种不同的LMP基因转基因载体,即pBR322-MT-LMP,pMci3-LMP和pMV-LMP-c-myc;并分别讨论了上述三种载体的特征及其应用前景.
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pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体构建、表达及其抗原递呈功能研究
目的 构建可以表达人类HLA-DRB1*0803的转基因载体,并在细胞水平验证其表达及抗原递呈功能.方法 提取人WATANABE细胞株(基因型为HLA-DRB1 *0803纯合子)的总RNA,RTPCR扩增DRB1*0803基因片段,与小鼠Eα promoter和兔β-globin基因内含子序列同时导入pBR002-lacz载体.pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体转染小鼠DCS细胞和B细胞系,用Western blot和免疫荧光的方法对HLA-DRB1蛋白进行检测.流式细胞术检测转染小鼠DCS细胞对HBcAg特异性CD4+T细胞的刺激和极化效应.结果 经双酶切和测序验证,成功构建了pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体;转染载体后的小鼠DCS细胞和B细胞系均表达出了大小约为29×103的HLA-DRB1蛋白;免疫荧光结果表明HLA-DRB1蛋白主要表达于细胞质内.转染后的小鼠DCS细胞可将负载的HBcAg递呈给HLA-DRB1 *0803阳性基因型的人CD4+T细胞,产生明显的CD4+T细胞应答.结论 成功构建了HLA-DRB1 *0803转基因载体,该载体可以在细胞水平特异性表达HLA-DRB1蛋白,并具有HLA-DRB1*0803特异性抗原递呈功能.
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转基因猪体细胞核移植基因载体和供源选择的研究进展
体细胞核移植是动物转基因的常用手段.通过核移植技术获得转基因猪已经成为目前转基因猪新品种培育的主流技术,而载体和供核细胞的选择是转基因能否成功的关键,本文就这两方面的研究进展进行综述.
