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不同饲料硒水平饲养大鼠的多组织内参基因筛选
目的 筛选不同饲料硒(selenium,Se)水平饲喂大鼠时,不同组织中稳定表达的内参基因(reference genes,RGs).方法 24只断乳雄性SD大鼠在缺Se饲养5周后,随机均分为4组,分别以Se含量＜0.01、0.25、3、5 mg/kg饲料饲喂4周后处死,取肝、睾丸、骨骼肌、脂肪组织等样品待检.以荧光定量PCR检测Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rplp2、Rps18、Tbp、Ywhaz等12个候选内参基因的mRNA水平,以geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT和RefFinder等方法对其表达稳定性进行评价.结果 各组织中稳定性排名前4的内参基因是:肝中Ppia＞Atp5f1＞Rplp2 ＞Hprt;睾丸中Ywhaz＞Atp5f1 ＞Rplp2＞ Ppia;骨骼肌中Tbp＞Ppia＞B2m＞Rps18;脂肪组织中Hprt＞ Tbp ＞Atp5f1 ＞Pgk1;综合4种组织,则Rps18＞Hprt＞Rplp2＞Atp5f1.结论 分析不同饲料Se水平饲养大鼠的目标基因表达水平时,应根据组织类型选择适宜的内参基因.
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罗汉果实时荧光定量PCR内参基因的选择
罗汉果为药食两用的传统中药,研究从罗汉果转录组中选取了Actin,18 SrRNA,ubiquilin,efl-α,ef1-β,Tubulin作为候选基因,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT,RefFinder软件和方法对6个候选参考基因在不同罗汉果样品中的表达稳定性进行分析,首次筛选出了不同时期的有籽和无籽罗汉果果实中较理想的内参基因,结果发现18SrRNA在所有罗汉果样品中表达稳定,是样品基因分析适合的内参基因,对采用qRT-PCR方法分析罗汉果基因表达中内参基因的选择具有指导作用,也为罗汉果生物合成途径基因及其他不同条件下基因差异表达研究提供参考,确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性.
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基于实时荧光定量PCR对镉处理下黄花蒿内参基因稳定性的分析
研究选取黄花蒿的Actin,18S rRNA,PAL,GAPDH,CPR作为候选内参基因,设计特异性引物,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT以及RefFinder软件和方法对5种内参基因在不同浓度镉处理下黄花蒿叶片中的表达稳定性进行分析,为黄花蒿基因差异表达研究提供可靠的内参基因,确保黄花蒿基因表达分析结果的可靠性.结果表明在不同浓度镉处理下,黄花蒿叶片中候选内参基因的表达稳定性存在差异,综合分析得出候选内参基因表达稳定性顺序依次为Actin＞ 18S rRNA＞ PAL＞ GAPDH＞ CPR.因此,在黄花蒿基因差异表达分析中,可以考虑选取Actin,18S rRNA,PAL作为内参基因,采用多内参校正结果.此外,研究还发现同浓度镉处理下黄花蒿叶片中的候选内参基因表达稳定性也存有差异,这说明即使在同一处理条件下也有必要进行内参基因的筛选.总之,该研究首次提供了在不同浓度镉处理下黄花蒿叶片中比较理想的内参基因,也为其他条件下黄花蒿的基因表达分析提供了参考.
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老年大鼠组织mRNA分析中内参基因的选择
目的 探讨用于老年大鼠组织基因mRNA表达分析的内参基因选择.方法 用实时反转录PCR技术评价5个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3pd)、β-肌动蛋白(ACTB)、H3组氨酸3B(H3f3b)、酸性核糖体磷蛋白P0(Arbp)和18S核糖体RNA(18S)的表达水平.结果 老年大鼠肾组织中表达稳定的是管家基因ACTB,心脏和肺组织中表达稳定的是G3pa;而Arbp在不同组织之间的表达差异小.结论 老年大鼠组织间基因表达mRNA分析应使用至少两个参照基因:一个是核糖体基因18S,另一个适合的内参基因是Arbp.
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家蝇GAPDH基因的克隆、表达及作为内参的可靠性分析
目的 探讨家蝇甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因在不同饲料饲养、不同发育期及不同组织的转录和表达情况,评价其作为家蝇功能基因研究内参的稳定性. 方法 运用PCR技术扩增GAPDH基因完整编码序列,生物信息学方法预测该基因及其编码蛋白功能.构建pET-28a(+)-GAPDH重组质粒,转化到大肠埃希菌Transetta (DE3)中进行诱导表达,纯化重组蛋白制备多克隆抗体.运用Real-time PCR和Western blot检测家蝇不同发育期、三龄幼虫不同组织和不同饲养物处理下GAPDH基因的表达情况. 结果 家蝇GAPDH基因ORF全长999 bp,编码332个氨基酸,理论分子质量37.3 ku,等电点为8.57,具有GAPDH家族的蛋白保守结构域;构建的重组质粒经PCR及测序鉴定正确;SDS-PAGE分析显示重组质粒在Transetta (DE3)中表达,纯化后的表达产物与目的蛋白大小相符,Western blot显示该蛋白可被相应血清识别;Real-time PCR分析GAPDH基因在不同饲料饲养3龄幼虫、不同发育期均保持较好的转录稳定性,同时,Western blot分析GAPDH分子在家蝇不同发育期及3龄幼虫不同组织中均有表达,且表达量无明显差别. 结论 GAPDH基因在不同发育期、不同组织及不同饲养物饲养的家蝇表达稳定,可作为家蝇可靠性内参基因使用.
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胶质瘤组织实时定量 PCR 检测中内参基因的选择
目的筛选胶质瘤组织中表达稳定性高的内参基因，为胶质瘤基因表达研究选取合适的内参基因提供实验基础。方法以相对正常脑组织及胶质瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期组织共25例为实验对象，利用Real-time PCR技术对15个候选内参基因进行筛选，通过geNorm软件对实验结果进行数据分析。结果在15个内参基因中，GUSB、ACTB、TBP、GAPDH、ATP5F1和PPIA 6个基因表达稳定，平均表达稳定度（ M值）均＜0.5，其中ATP5F1和PPIA为表达稳定的两个内参基因，其M值为0.26。标准化因子V2/3＝0.102，小于取舍值0.15。结论在胶质瘤组织实时定量PCR分析中，ATP5F1和PPIA2个内参基因联合使用，可较好地共同校正基因表达结果。
关键词： 神经胶质瘤 实时定量聚合酶链式反应 内参基因 -
如何利用geNorm软件筛选基因表达测定的内参基因?
答:随着实时荧光定量PCR成为检测基因表达谱的高通量、高精度的方法,基因表达分析在生物学研究中得到广泛应用.采用稳定的内参基因对反应进行标准化可以增加该方法的敏感度、重复性和动态范围,理想的内参基因在所研究的组织、细胞和实验条件下均恒定表达.管家基因是维持细胞低限度功能不可少的基因,在所有类型细胞中都表达,是广泛应用的内参基因.但是,很多研究表明管家基因在不同组织、细胞以及不同条件下表达量并非永远恒定,甚至差别很大,至今尚未发现在所有条件下均恒定表达的管家基因.因此,对特定基因表达研究中候选管家基因的表达稳定性进行评价,筛选出为稳定的管家基因作为内参基因,对保证研究结果的真实、可靠至关重要.
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航天环境对拟南芥幼苗内参基因表达稳定性的影响
目的 筛选在航天环境下表达稳定的拟南芥幼苗内参基因.方法 “神舟”8号飞船搭载拟南芥幼苗,设置3个试验处理:1)空间飞行处理(F ug);2)空间飞行+1g离心力处理(F1g);3)地面对照(G1g).样品返回后,提取总RNA,通过实时定量RT-PCR的方法,利用geNorm软件分析8个内参基因:ACT8,EF1α,eIF4A,YLS8,UBQ5,ACT2,TIP41和UBC8.结果 三个处理中,内参基因表达的稳定性如下:TIP41=UBC＞ACT2＞UBQ5＞YLS8＞eIF4A＞EF1α ＞ACT8,其中ACT2,TIP41和UBC的M值小于0.5.结论 利用qRT-PCR分析比较太空中拟南芥幼苗基因表达差异时,ACT2,TIP41和UBC可作为内参基因.
关键词： 航天环境 拟南芥 内参基因 实时定量RT-PCR -
内生真菌对大花红景天中红景天苷合成代谢途径中关键酶基因表达的影响
以活性内生真菌ZPRa-R-1促进大花红景天积累红景天苷为基础,筛选红景天苷合成代谢途径中管家基因的稳定性,建立以双内参基因评价红景天苷合成代谢中关键酶基因表达规律的方法.通过实时荧光定量PCR,以及geNorm、NormFinder、BestKeeper等软件分析管家基因的稳定性,利用2-△△Ct的方法分析关键酶基因的相对表达量.结果表明,真菌ZPRa-R-1与大花红景天互作条件下,甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的表达稳定,其次是PCS;精确的校准误差方法为双内参基因组合;真菌ZPRa-R-1对红景天苷合成代谢关键酶基因及其表达产物产生规律性影响:互作8天时,尿苷-磷酸葡萄糖转移酶(UDPGT)基因的相对表达量达到对照组的17.1倍;互作10天时,PAL相对表达活性达到峰值,为对照组的4.9倍;互作12天时,TyDC基因相对表达量达到大,为对照组的2.8倍;而对TAT表达量影响较小.同时,关键酶基因表达的变化与终产物红景天苷呈正相关关系.
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内生菌Phialocephala fortinii影响大花红景天代谢的差异途径及基因表达
药用植物发育和代谢受到多种因素的影响,而内生真菌对植物的影响是近年来才得以重视并逐步成为热点.为探索内生真菌Phialocephala fortinii对大花红景天基因及代谢途径的影响,本实验通过RNA转录组测序筛选差异表达基因;并用Real-time PCR对基因表达进行验证,利用2-△△Ct的方法分析脂代谢、信号转导和环境适应性等重要代谢途径差异基因的相对表达量.结果表明,验证结果与测序结果一致,内生真菌P.fortinii能够促进大花红景天脂代谢途径中的差异基因表达量;它对信号转导途径中相关基因表达的影响不同,但控制Notch信号通路途径的基因表达量显著提高,为对照组的34倍;对适应性代谢途径差异基因表达上调,进而促进红景天环境适应能力.研究结果旨在为揭示内生真菌与红景天的互作机制、红景天道地性形成原因、内生真菌功能的开发等提供分子基础数据.
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铁皮石斛实时定量PCR内参基因的筛选
目的 筛选铁皮石斛(Dendrobium officinale)实时定量PCR(real time quantitative PCR,qPCR)佳内参基因.方法 采用同源克隆法、RT-PCR分离候选内参基因;qPCR分析基因的引物扩增效率及相对表达量;geNorm分析内参基因的表达稳定性;qPCR检测法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的表达模式.结果 分离到铁皮石斛ACT-1、ACT-2、EF-1α、GAPDH、β-TUB、18S rRNA、26S rRNA等7个候选内参基因片段,引物扩增效率分别为2.12、1.98、2.03、2.08、1.97、2.18和2.05;geNorm分析表达稳定性大小为EF-1α/18S rRNA＞ACT-1＞ACT-2＞GAPDH＞β-TUB＞26S rRNA;以EF-1α/18S rRNA为标准分析FPS基因的相对表达量大小为种子＞根＞原球茎＞茎＞叶.结论 确定珍稀濒危兰科药用铁皮石斛qPCR分析的佳内参基因,为基因表达研究提供依据.
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浅低温体外循环手术前后基因表达研究中内参基因的选择
目的 筛选浅低温体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)手术前后基因表达变化研究的内参基因.方法 通过阅读文献选择基因表达研究中常用的11个管家基因(housekeeping genes,HKGe),采用Beacon Designer软件设计PCR引物;收集4例浅低温CPB辅助手术患者CPB前、体温低点、CPB末以及术后1d、3d、7d的静脉血24份,提取总RNA,采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR法检测各样品中11个HKGe的循环阚值;对所得循环阈值进行转换,采用geNonn程序对候选基因的表达稳定性和所需内参基因数量进行分析.结果 11个HKGs稳定性排序为:UBC
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定量PCR分析人肺癌细胞NCI-H1299基因表达的内参基因选择
目的 评价实时荧光定量PCR分析人肺癌细胞NCI-H1299中Merml/Wbscr22基因表达时6个候选内参基因表达的稳定性,筛选适的内参基因.方法 选择ACTB、B2M、GAPD、HPRT1、RPL32及TBP作为候选内参基因,利用geNorm,NormFinder及RefFinder程序分析实时荧光定量PCR数据,评价6个候选内参基因在NCI-H1299细胞株中的表达稳定性,筛选适内参基因,同时观察选用不同内参基因对目的基因相对表达量分析的影响.结果 6个候选内参基因在NCI-H1299细胞株中的表达稳定性由强至弱排序为:RPL32＞ HPRTl＞ GAPD＞ ACTB＞ TBP＞ B2M,选择不同内参基因影响目的基因Merml/Wbscr22的相对表达量.结论 RPL32+ HPRT1是实时荧光定量PCR分析人肺癌细胞NCI-H1299中Merml/Wbscr22基因表达的适内参基因组合.
关键词： 实时荧光定量PCR 内参基因 Merm1/Wbscr22 基因表达 -
人参β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立
目的 建立人参β-actin基因实时荧光定量PCR的方法.方法 根据GenBank上其他高等植物β-actin基因保守区域设计一对特异性引物,将从人参中PCR扩增得到的β-actin基因克隆到pMD20-T载体上构建重组质粒,经1/10梯度稀释后用于制定标准曲线,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验. 结果 该方法检测β-actin基因的低拷贝数为43拷贝/μL,在较广的范围内(43～4.3×107拷贝/μL)有良好的线性关系(R2=0.995 3);熔解曲线分析显示扩增产物为特异性单峰,其Tm值为(84.51±0.01)℃;5个不同浓度对照品组内试验变异系数为0.58％～2.79％,组间试验变异系数为2.61％～4.41％.结论 该方法具有快速、灵敏、特异、高通量及重复性强等优点,为β-actin基因作为内参基因进行人参功能基因表达的定量分析提供了方法学基础.
关键词： 人参 内参基因 基因克隆 实时荧光定量PCR SYBR Green Ⅰ -
灰毡毛忍冬内参基因筛选和Mads-box家族基因AGL15的时空表达分析
目的 筛选灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides基因表达分析的内参基因,研究其Mads-box基因家族AGL15基因(LmAGL15)的时空表达特性.方法 克隆灰毡毛忍冬内参基因18 S rRNA、Ubiquilin、Actin和Efl-β的基因片段,评价了4个基因在不同部位叶、茎和花蕾,以及4个基因在灰毡毛忍冬生长不同时期的稳定性,筛选内参基因,分析LmAGL15基因的时空表达特性.结果 18 S rRNA表达稳定,适宜作为内参基因,叶片、茎的LmAGL15基因相对表达量较低,花蕾相对表达量较高.花蕾不同发育时期,LmAGL15的相对表达量呈现逐渐降低的变化,20 d后LmAGL 15的相对表达量低,然后依次是花蕾初期(15 d)、青绿色花蕾期(10d)、绿白色花蕾期(5 d).结论 18 S rRNA是适宜的内参基因.叶片、茎和花蕾中,LmAGL15的相对表达量差异明显.花蕾发育不同时期,LmAGL15的相对表达量呈逐渐降低的变化,与花蕾开放变化规律相似.
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LPS诱导下THP-1细胞基因表达内参基因的筛选
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的主要病理基础,引起AS的病因很复杂.巨噬细胞在其发生、发展过程中有重要作用[1,2].抑制巨噬细胞的炎症反应有可能成为预防和治疗AS的一个重要的方向.已知人单核白血病(THP-1)细胞具有单核细胞和巨噬细胞的功能和生理学特性,被广泛用于毒理学、免疫学和动脉粥样硬化等研究领域[3].而G-细菌细胞膜的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以刺激单核巨噬细胞系统发生免疫反应[4].明确LPS刺激THP-1细胞的基因转录水平将有助于揭示AS的病因.
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尸体组织中内参基因的稳定性及年龄影响分析
死亡时间的准确推断尤其是晚期死亡时间的准确推断是法医病理学研究中亟待解决的问题.研究表明在一定条件下,RNA可以保持一定程度的稳定性并有望应用于法医学实践,尸体RNA的稳定性及时序性变化研究在损伤时间推断、死亡时间推断甚至死亡原因、死亡机制的判断方面有着极其广泛的法医学应用价值[1].
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内参基因β-actin质粒标准品的构建
为构建检测内参基因β-actin mRNA表达水平差异的标准品,以成人外周血细胞的总RNA为模板、Random 6 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA片段,构建PMD-18-β-actin重组质粒,鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线.结果外周血提取的总RNA完整性良好,构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到-186 bp的清晰条带.测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为2.39×1013copies/mL,倍比稀释至2.0×104copies/mL均能得到良好的标准曲线(R2=1),提示构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功.
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荧光定量聚合酶链反应法比较标准管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠不同组织中的表达
背景:反转录聚合酶链反应用于基因表达分析越来越显示出其重要性,其中合适的内参基因选择很重要,目前并没有适合于所有体系可作为内参的管家基因.人鼠是常用动物模型,选择合适的大鼠管家基因作为内参尤其必要.目的:比较分析使用广泛的4个标准管家摹因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠肝、肾、心、肺组织和大脑皮质中的表达情况.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-07/08在泰山医学院生命科学研究所分子生物学实验室及泰安市疾控中心病毒检测中心实验室完成.材料:选用老年SD大鼠3只,用于检测管家基因表达情况.方法:采用反转录实时荧光聚合酶链反应技术检测老年大鼠肝、肾,心、肺组织和大脑皮质中有着不同表达丰度和功能的4个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA的表达情况.主要观察指标:老年大鼠不同组织内4个管家基因的表达水平及不同组织间的表达差异.结果:①酸性核糖体磷蛋白P0在老年大鼠不同组织间表达差异小.②老年大鼠肾组织中表达稳定的管家基因是β-肌动蛋白:心脏组织和肺组织中表达稳定的管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶.结论:老年大鼠组织间信使RNA分析仅用1个内参基因是不合适的,至少应该使用两个参照基因,1个选用18S核糖体RNA:另一个基因的选择标准如下:适用于分析不同组织间基因表达情况的内参基因是酸性核糖体磷蛋白P0,而心脏和肺组织研究适用3-磷酸廿油醛脱氢酶,肾组织研究适用β-肌动蛋白.
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孕妇血浆DNA中内参基因拷贝数稳定性的评价
目的:探讨孕妇血浆和非孕妇血浆游离DNA中常用内参基因的拷贝数稳定性,为孕妇血浆游离DNA的定量研究提供参考.方法:选择孕龄为12周左右的健康孕妇及健康未孕女性各18名,取外周静脉血并提取血浆DNA,将DNA样本分为孕妇与非孕妇整体组、孕妇组、非孕妇组、母体与胎儿整体组、母源DNA组和胎源DNA组,选取β-珠蛋白(HBB)、端粒酶(TERT)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、白蛋白(ALB)、β-肌动蛋白(ACTB)和T细胞受体γ(TRG)为内参基因.采用实时荧光定量PCR (qPCR)法分析血浆DNA中内参基因Ct值,分别采用3款统计学软件geNorm、NormFinder和BestKeeper比较6种内参基因在各组样本中的拷贝数稳定性.结果:①qPCR法,6种内参基因的所有PCR产物均特异性扩增.各组内参基因Ct值比较差异均无统计学意义(P＞0.05).各组ACTB的Ct值低,HBB次之,即血浆DNA中ACTB和HBB拷贝数高.②按照geNorm软件计算结果基因稳定值(M)由高到低的顺序、NormFinder软件计算结果含量稳定性由高到低的顺序、BestKeeper软件计算结果相关系数(R)由高到低的顺序,在各组样本中将6种内参基因按照其拷贝数稳定性由高到低进行排序.综合分析3种软件的分析结果,在孕妇与非孕妇整体组、孕妇组、非孕妇组、母体与胎儿整体组、母源DNA组和胎源DNA组中,拷贝数稳定性高的内参基因分别为TERT、ACTB、ALB、HBB、HBB及HBB.③母体与胎儿整体组、母源DNA组、母源DNA组和胎源DNA组内参基因的Ct值比较差异均有统计学意义(F=114.84,P＜0.05).结论:当采用qPCR法对来自于孕妇与非孕妇整体、孕妇、非孕妇、母体与胎儿整体、母源DNA和胎源DNA的血浆游离DNA进行定量分析时,推荐分别选择TERT、ACTB、ALB、HBB、HBB及HBB作为校正内参基因.
