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北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3,BcUGT6的表达分析及其原核表达
该研究测定了北柴胡中2个糖基转移酶基因BcUGT3和BcUGT6在不同组织中的转录水平及MeJA处理后不定根中的转录水平.BcUGT3在根、叶、花和果中的转录水平无明显差异,但均高于茎中的转录水平.BcUGT6在叶中转录水平高,在花中低.以未处理的为对照,BcUGT6在MeJA处理后2h,8h,24h,2d,4d的北柴胡不定根中,转录水平均提高近2倍,表明BcUGT6的转录受MeJA影响较小.BcUGT3转录水平随处理时间的延长不断增加,4d时,达7倍左右.利用载体pET-28a(+),进行了2个基因的原核表达.IPTG诱导后,宿主菌表达出了目的蛋白,并获得了纯化蛋白.为后续开展这2个基因的功能研究奠定了基础.
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北柴胡UGT基因的克隆及其过量表达和RNAi转基因载体的构建
目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的UGT基因,构建其过表达和抑制表达的转基因载体,为通过转基因验证其功能奠定基础.方法:在454高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过RACE和LD-PCR方法扩增全长cDNA克隆.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增UGT基因的ORF和部分片段后,酶切,分别插入到pCAMBIA-SUPER1 300和pHANNIBAL中.重组的pHANNIBAL经Not(I)酶切后插入到pART27中.终以构建出过表达和抑制表达的转基因载体.结果:扩增到了北柴胡1个UGT基因全长cDNA克隆,构建了这一基因的过表达和抑制表达转基因载体.结论:通过UGT基因的全长cDNA克隆和转基因载体构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础.
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北柴胡糖基转移酶基因BcUGT1的表达分析及其原核表达与蛋白纯化
本研究分析了北柴胡糖基转移酶基因BcUGT1ORF序列,预测了其蛋白三维结构,利用qRT-PCR分析了BcUGT1的茉莉酸甲酯诱导表达和组织表达特性.结果表明,BcUGT1可能参与柴胡皂苷生物合成.随后,构建了BcUGT1原核表达载体,成功诱导出目标蛋白,并进行了纯化.原核表达实验中共采用了3种载体:pRSET-A、pET-28a(+)和pET-30a(+),3种宿主菌:BL21 (DE3) plysS、BL21A1和BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL,进行了不同诱导条件的探索,包括不同诱导物(L-阿拉伯糖和IPTG)的不同浓度、不同诱导时间和温度,结果以pET-28a(+)和pET-30a(+)为载体,BL2 1-CodonPlus (DE3)-RIPL为宿主菌,0.5或1 mmol·L-1 IPTG,16℃,20 h为条件,诱导出目标蛋白.利用PrepEase(R) His标签蛋白纯化试剂盒,纯化获得了目标蛋白,为后续开展BcUGT1基因的功能研究奠定了基础.
