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华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析
目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析.方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件和ExPASy在线分析等对其进行了生物信息学分析.结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的cDNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80％以上.结论:获得了AsPAL cDNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础.
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内生真菌对台湾金线莲栽培及酶活性的影响
目的:研究在野外盆栽条件下内生真菌对台湾金线莲的影响.方法:组培苗移栽1年后收获,统计成活率,称鲜重和干重,同时测定几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活性.结果:接菌的台湾金线莲成活率达100%.对台湾金线莲鲜重的增加有极显著差异,对干重的增加有显著差异,且接菌后4种酶活性均高于对照组.结论:在台湾金线莲的家栽过程中可利用内生真菌提高成活率.
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光对植物黄酮类化合物的影响研究进展
黄酮类化合物是植物中普遍存在的一类次生代谢产物,对植物自身起着非常重要的作用,光保护和抗氧化是主要作用,因此光照对黄酮类化合物的生物合成的影响十分显著.该研究从光强和光质2个方面综述了近年来光照对植物中黄酮类化合物含量的影响,以及简要概述了光作用于黄酮代谢上游关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查尔酮合酶(CHS)的特点.
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我国南方薏苡种质资源对黑粉病的抗病性鉴定
目的:通过常规田间鉴定方法,从不同来源的薏苡种质资源中筛选优良抗病种质,同时探讨室内快速生化鉴定方法的可行性.方法:采用田间人工接种试验,对来自云南、浙江、福建等7个省市的19份南方生态型栽培及野生薏苡种质进行黑粉病的抗性鉴定,并通过室内种苗接种试验,观察田间表现抗性不同的种质在接种病原菌后苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的动态变化.结果:田间接种的19份薏苡种质中,有1份免疫种质,发病率在20%以下的抗病种质1份,发病率在20%～40%的6份,40%以上的感病种质11份;表现不同抗性的种质其种苗接种黑粉菌孢子后12～48 h,PAL的变化有明显差异,抗病性强的种质PAL活性高峰出现较早,酶活相对较强.结论:所收集的大部分薏苡种质抗病性较弱;室内接种黑粉菌孢子后,薏苡种苗的PAL活性高峰期出现的时间及活性高低,可以作为薏苡种质资源抗病性鉴定的辅助手段.
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外源H2O2对黄芩次生代谢调控及道地质量形成机制研究
中药材需求量的增加,野生药材已不能满足临床需要,栽培药材成为商品的主要来源.由于生长环境的改变,导致很多药材质量下降.提高药材质量已成为中药资源研究的重点和难点.采用H2 O2喷施黄芩地上部分,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)变化不明显,过氧化物酶(POD)和抗坏血酸氧化酶(APX)活性显著下降,表明黄芩抗氧化酶系统消除活性氧能力降低.同时,H2O2促进苯丙氨酸解氨酶(PAL)和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因表达,提高了PAL活性,促进了黄酮类成分的生物合成和苷元类成分的转化.0.004 μmol· L-H2O2处理后第2天,虽然黄芩苷和汉黄芩苷等苷类物质略有下降,但活性高的成分苷元类成分显著升高,黄芩素由0.094％升高到0.324％,汉黄芩素由0.060％升高到0.110％,分别比对照提高了246％,83.3％.
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利用体外靶点效率检测指导丹参SmPAL1基因的CRISPR/Cas9载体构建
为定向编辑丹参苯丙烷代谢途径中关键酶基因SmPAL1构建CRISPR/Cas9载体,通过在线软件设计CIRSPR/Cas9靶位点,采用体外酶切法进行体外靶点效率检测,筛选活性高的序列,构建到CRISPR/Cas9载体中.设计了3个可能的CRISPR/Cas9靶位点(SmPAL1-g1,SmPAL1-g2,SmPAL1-g3),通过体外靶点效率检测,其活性分别为53.3％,76.6％,10.0％,将筛选出活性较高的2个靶位点SmPAL1-g1和SmPAL1-g2构建到载体VK005-03中并命名为VK005-03-g1和VK005-03-g2.测序结果显示,设计的2个CRISPR/Cas靶位点全部插入到VK005-03中,载体构建成功.
关键词： 丹参 苯丙氨酸解氨酶 CRISPR/Cas9 基因编辑 靶点效率检测 -
内生真菌对福建金线莲栽培及酶活性的影响
目的 研究在野外盆栽条件下内生真菌AR-18对福建金线莲(Anoectochilus roxburghii)生长发育的影响.方法 福建金线莲组培苗接菌移栽于草炭土或蛭石基质中,1年后收获,观察苗的生长势,统计成活率,称鲜重和干重,同时测定β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性.结果 在草炭土和蛭石基质上,接菌的福建金线莲苗成活率均达100%;真菌对福建金线莲鲜重的增加有极显著促进作用(P<0.01),分别为对照组的1.77和1.83倍;真菌对福建金线莲干重的增加有显著促进作用(P<0.05),分别为对照组的1.13和1.28倍.接菌后4种酶活性均高于对照组.结论 在福建金线莲的家栽过程中可利用内生真菌提高成活率和产量.
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基因工程苯丙氨酸解氨酶对多发性骨髓瘤U266细胞的作用研究
目的 为寻找对多发性骨髓瘤新的治疗方法 ,从基因工程乳酸乳球菌提纯苯丙氨酸解氨酶(PAL),探讨PAL酶对多发性骨髓瘤U266细胞系的影响作用.方法 利用已构建成功的高表达PAL的基因工程乳酸乳球菌,结合物理、化学、生物学等方法 ,设计一种简便、高效提纯PAL酶的方法.培养人多发性骨髓瘤U266细胞系,在不同浓度基因工程PAL酶作用后.以MTT法检测细胞增生;流式细胞仪检测细胞凋亡;HPLC检测细胞培养液中苯丙氨酸(phe)浓度.结果 ①用本研究所设计方法 从基因工程乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-palart中提取的PAL酶比活性可达同量原菌的92.5%;②0.1～2.0U/ml的PAL提取液作用24h后能显著抑制U266细胞生长,并呈剂量依赖性;③只添加提取过程所用试剂的对照组细胞生长无明显抑制;④0.1U/ml、0.2U/ml、2.0 U/ml的PAL酶作用24h后的MM细胞早期凋亡率分别为(21.92±0.95)%、(50.64±0.86)%、(90.86±2.91)%;⑤PAL酶作用24h后细胞培养液中phe浓度随PAL酶活性增加而降低.结论 本研究所设计方法 可从基因工程乳酸菌高效提取PAL酶;提取过程中的添加试剂对MM细胞生长无明显抑制作用;PAL酶能显著抑制MM细胞体外生长,诱导细胞早期凋亡;PAL酶可降低培养液中的phe水平,且phe浓度与MM细胞生长的抑制作用具有相关性.
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姜黄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析
目的 对姜黄Curcuma longa苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(CurPAL)全长进行克隆并开展生物信息学分析,为姜黄次生代谢产物的生物合成机制研究奠定基础.方法 利用RT-PCR和RACE相结合的方法,以姜黄叶片cDNA为模板,克隆获得CurPAL全长,进行生物信息学分析.结果 克隆的CurPAL(登录号为KJ780359)全长cDNA为1293bp,其中包括5'-UTR 243 bp,3'-UTR 123 bp,含有1个927bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码308个氨基酸;预测蛋白质相对分子质量为33 000,理论等电点pI为5.76; CurPAL蛋白性质稳定,为可溶性蛋白;CurPAL编码的蛋白质序列包含与夹竹桃PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点,氨基酸序列多重比较发现,CurPAL编码的氨基酸序列与中国李、浙江红山茶、拟南芥、辣椒、小果野蕉PAL氨基酸序列的同源性达到75％以上;与姜目类的植物(如小果野蕉)的PAL聚为一支,说明两者亲缘关系较近;通过蛋白质二维、三维结构的预测,表明CurPAL蛋白为全α型蛋白,由同源四聚体构成.结论 首次克隆并获得CurPAL基因全长cDNA,为姜黄素生物合成途径的阐明和改善中药材品质提供科学依据.
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膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析
目的 对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析.方法 应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因.结果 所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Oenbank登录号为EF567076.序列分析表明,AmPAL全长为2 650 bp,含有一个完整的2 154 bp开放读码框.AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×10~4,等电点为5.96.与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%.结论 首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础.
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花青素生物合成的关键酶及其调控因子
花青素具有抗氧化、抗炎、调节血脂、抗肿瘤等一系列生物活性,在药物或保健品开发中显示出重要的潜力.对花青素生物合成过程中的关键酶包括苯丙氨酸解氨酶、查耳酮合成酶、查耳酮异构酶、黄烷酮3-羟化酶、类黄酮3’-羟化酶、类黄酮3',5'-羟化酶、二氢黄酮醇-4-还原酶、花色素合酶、类黄酮3-O-糖基转移酶及其调控因子R2R3-MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白的研究进展进行综述.
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苯丙氨酸解氨酶脂质体的制备及其抗白血病细胞增殖作用的初探
目的探讨苯丙氨酸解氨酶(PAL)脂质体对小鼠白血病L1210细胞和人白血病K562细胞生长的抑制作用. 方法采用改良的逆相蒸发法制备出PAL脂质体,应用MTT还原法分别检测PAL脂质体和游离的PAL对L1210和K562细胞增殖的作用.结果在酶活性相同条件下,PAL脂质体比游离PAL有较强的抑制细胞增殖作用,对K562细胞作用48h, IC50分别为0.905U/ml和1.140U/ml, 对L1210细胞作用48h, IC50分别为0.958U/ml和1.513U/ml.结论 PAL脂质体能抑制L1210和K562白血病细胞增殖,并呈时间和剂量依赖关系(P<0.01).
