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流感疫苗研究进展
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病,接种流感疫苗是预防流感病毒传播的主要手段.本文主要针对流感的灭活疫苗、减毒活疫苗、以哺乳动物细胞为基质的流感疫苗、DNA疫苗和反向遗传学技术在研究开发流感疫苗上的应用进行综述.
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痘苗病毒载体在冠状病毒反向遗传学中的应用
反向遗传学方法是研究RNA病毒的主要方法,痘苗病毒载体则是感染性克隆技术的主要媒介,目前这一技术已趋向成熟并扩大其应用领域及对象.本文对痘苗病毒载体的构建、在冠状病毒反向遗传学中的应用情况以及目前该领域的进展作一综述.
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穿心莲八氢番茄红素脱氢酶ApPDS的基因克隆及功能鉴定
采用RT-PCR和RACE技术从穿心莲植株中克隆得到了八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的全长cDNA,预测有一个l 752bp的完整开放阅读框(序列已登录GenBank,登录号KP982892),编码584个氨基酸.序列同源性分析,穿心莲PDS编码的氨基酸序列与芝麻、广藿香、黄芩等其他植物的PDS有很高的同源性,该蛋白包含一个共有的氨基酸脱氢酶的辅酶结构域NAD(H)-binding domain.利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析,发现PDS基因在穿心莲的根、茎、叶、花中均有表达,表达量为叶＞花＞茎＞根.用病毒诱导基因沉默(VIGS)的方法在穿心功莲体内鉴定ApPDS的功能,构建VIGS载体pTRV2-PDS,经农杆菌浸染穿心莲叶片,植物表型观察、定量RT-PCR检测ApPDS基因的表达,结果观察到叶片轻微变黄和明显的基因下调,鉴定了ApPDS在体内的功能.该研究首次克隆并鉴定了穿心莲PDS基因,为进一步研究穿心莲中新基因尤其是穿心莲内酯类二萜生物合成基因的功能奠定了基础.
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口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定
设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡.以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒.
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乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步研究
通过构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的全长cDNA克隆,来初步探讨将其作为表达载体的可行性,为下一步利用乙型脑炎病毒作为载体构建嵌合病毒打下基础.利用长片段RT-PCR的方法分两段扩增出乙型脑炎病毒cDNA,通过片段两端的酶切位点,将cDNA依次连接到pACYC184载体.进一步利用分子克隆的手段,在乙型脑炎病毒基因组cDNA的3 '非编码区插入增强型绿色荧光蛋白(Ehanced green fluorescent portein,EGFP)基因作为报告基因,通过体外转录和转染,拯救乙型脑炎病毒和表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎嵌合病毒.采用RT-PCR、蚀斑实验和荧光显微镜观察等方法对恢复病毒进行鉴定.对恢复病毒进行连续6次细胞传代,从病毒生长特性和结构基因稳定性的角度对恢复病毒传代稳定性进行研究.结果表明成功地扩增并构建得到乙型脑炎病毒的全长cDNA,在此基础上进一步构建得到了乙型脑炎嵌合病毒rJEV-EGFP全长cDNA,经过体外转录和转染获得了活的rJEV病毒及嵌合病毒rJEV-EGFP,并采用了多种方法对其进行了鉴定,拯救出的恢复病毒在已传代的代次内稳定性良好,嵌合病毒rJEV-EGFP可稳定地表达绿色荧光蛋白.本研究应用反向遗传学技术构建并在BHK-21细胞中成功地拯救出了rJEV和rJEV-EGFP活病毒,同时也表明乙型脑炎病毒SA14-14-2株可以作为载体来表达外源基因.
关键词： 乙型脑炎病毒 反向遗传学 全长cDNA感染性克隆 表达载体 增强型绿色荧光蛋白 -
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国新发现的一种布尼亚病毒,可引起人类严重发热伴血小板减少综合征.我们利用RNA聚合酶Ⅰ体系,分别构建SFTSV三个片段L、M、S微复制子,研究其非编码区调控功能.将报告基因绿色荧光蛋白( GFP)或荧光素酶(Luciferase)分别插入SFTSV三个片段5′和3′非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶Ⅰ的表达载体pHH21中,获得SFTSV微复制子重组质粒L-GFP-pHH21、M-GFP-pH H21、S-GFP-pHH21、L-Luc pHH21、M-Luc-pHH21和S-Luc-pHH21,分别与成功表达SFTSV聚合酶蛋白(L蛋白)和结构蛋白(N蛋白)的质粒VR1012-L和VR 1012-NP共同转染293T细胞,24～48h后观察GFP表达情况或检测萤光素酶表达量.L、M、S片段GFP微复制子均可观察到特异性绿色荧光.荧光素酶定量结果显示其在不同节段非编码区中的表达量不同,提示SFTSV三个节段的非编码区启动微复制子转录和复制的强度不同.
关键词： 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒 反向遗传学 微复制子 报告基因 -
反向遗传操作技术在呼肠孤病毒中的研究与应用
呼肠孤病毒科成员复杂,宿主范围广,对动物危害较大,使用经典遗传学方法解决呼肠孤病毒研究中出现的诸多科学问题受到限制,反向遗传学技术的发展和应用极大促进了呼肠孤病毒的基因组功能、蛋白质的作用、致病机制、新型疫苗开发等方面的研究.本文概述了呼肠孤病毒反向遗传操作技术的发展过程以及应用该技术取得的一些研究成果,并对该技术在呼肠孤病毒研究领域的推动作用进行了展望.
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猫杯状病毒反向遗传学操作系统的建立及其应用的研究进展
猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是引起猫呼吸道疾病的一种常见病原,自1995年以来,国内外相继建立了FCV反向遗传学操作系统并且FCV反向遗传学在病毒基因组结构与功能、表达外源蛋白、与宿主相互作用、致病机理等研究方面的应用已经取得了一些进展,本文通过收集FCV反向遗传学相关的研究文献,对FCV反向遗传学操作系统的建立及其应用研究进展进行综述,以期为相关领域的研究提供有益的参考与借鉴.
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流感病毒的反向遗传学研究进展
反向遗传学是指对病原微生物的cDNA进行目的性修饰,以对其进行功能和表型的分析[1].它是相对于经典遗传学而言的,后者是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律.反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容.与之相关的研究技术称为反向遗传学技术.在病毒学研究中,反向遗传学常利用经修饰的克隆化cDNA用来获得有感染性的病毒,从而可研究这些修饰对表型产生哪些影响.早报道的是正链RNA病毒的反向遗传学系统.将来自正链RNA的病毒全基因组RNA转染真核细胞,可使RNA充任mRNA(s),从而可翻译出病毒蛋白;反过来,这些蛋白又有助于完整病毒的包装.
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人肠道病毒D68型微复制子的建立
建立人肠道病毒D68型(EV-D68)微复制子体系.利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)或萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和Pol Ⅰ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pH H21-miniEGFP、pHH21 miniFLuc和pH H21-miniFLucap.lyC.微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平.T7和Pol Ⅰ系统微复制子均可表达报告基因,但Pol Ⅰ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍.并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用.本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具.
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狂犬病病毒反向遗传学及其应用
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的.经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律.反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入缺失置换等,再按组成顺序构建含有生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构和功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容.
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重组H9N2禽流感病毒的构建及其在不同细胞中的复制特性
目的 利用反向遗传学技术构建具有感染性的H9N2亚型禽流感病毒,并揭示其在不同细胞中的复制特性.方法 以A/Quail/HongKong/Gl/97(H9N2)禽流感病毒基因组RNA为模板,用RT-PCR技术获得该病毒的8条完整基因片段,并分别将它们插入到pHW2000载体上,终在293T细胞中包装产生重组H9N2病毒.并将重组的H9N2病毒感染不同细胞,观察病毒在不同细胞上的增殖状况来揭示该病毒在不同细胞上的复制特性.结果 应用流感病毒8质粒反向遗传学技术,成功获得重组病毒,并揭示了该毒株在不同细胞(A549,MDCK,Vero)中的复制特性,发现A549人肺腺癌细胞更适宜H9N2病毒的正常复制.此外还分析总结了该毒株的与病毒毒力相关的重要位点特征.结论 成功建立了H9N2禽流感病毒的反向遗传系统,该系统的建立为在分子水平研究H9N2病毒以及制备H9N2禽流感疫苗提供了依据.
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以乙脑减毒活疫苗SA14?14?2为骨架的重组嵌合登革4病毒的构建与鉴定
登革4型病毒近年来在我国东南沿海地区时有流行,威胁人民健康与公共卫生安全.本研究以乙脑减毒活疫苗SA14?14?2为骨架,通过反向遗传学技术构建了携带登革4型病毒主要结构蛋白prM/E基因重组嵌合病毒(ChinDENV4);进一步通过蚀斑、 生长曲线、 动物实验等对其生物学特征进行了鉴定.结果显示,重组嵌合病毒ChinDENV4可高效表达登革4型病毒的结构蛋白,蚀斑大小与亲本株类似;ChinDENV4并能够在BHK?21、C6/36等细胞中高效复制,滴度分别达到1.26×105和1.58×106 PFU/mL.更重要的是,嵌合病毒ChinDENV4在乳鼠模型中的神经毒力显著弱于亲本株.本研究成功构建了乙脑/登革4型嵌合病毒,为下一步四价嵌合登革减毒活疫苗研究奠定了重要基础.
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反向遗传学技术及其在狂犬病病毒研究中的应用
反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域.本文综述反向遗传学技术研究进展,并讨论该技术在狂犬病病毒(Rabies virus,RV)研究中的应用.
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用8质粒病毒拯救系统产生冷适应减毒的重组A型人流感病毒的研究
目的 利用流感病毒8质粒病毒拯救系统,产生冷适应减毒的重组A型人流感病毒,建立以冷适应流感病毒株为拯救骨架的反向遗传学技术平台.方法 以冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60(H2N2)流感病毒株作为拯救病毒的骨架,人工合成了该病毒株的6个内部基因片段,即PB2、PB1、PA、NP、M和NS,同时引入5个氨基酸突变作为标签.6个基因片段通过与改造后的转录载体pAD3000连接,构建6个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒:pMDV-A-PB2、pMDV-A-PB1、pMDV-A-PA、pMDV-A-NP、pMDV-A-M、pMDV-A-NS.结果 6质粒与PR8的表面基因HA和NA进行"6+2"组合的病毒拯救,8个重组质粒共转染COS-1细胞,成功拯救出了具有血凝活性的冷适应减毒的重组A型人流感病毒,命名为rMDV-A.鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝(HA)效价为1∶2 9～1∶2 10.结论 构建的A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因的病毒骨架拯救系统,为深入研究冷适应减毒人流感病毒的基因功能和新型疫苗研发提供了试验材料.
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麻疹减毒活疫苗 S191感染性克隆的构建及鉴定
目的：构建稳定的麻疹减毒活疫苗 S191感染性克隆。方法采用全基因合成方法获得麻疹减毒活疫苗 S191 cDNA 全长及辅助蛋白 N、P、L 基因片段，分别将该4个基因构建入转录与表达载体 pVAX1后，共转染293T 细胞，通过与 Vero 细胞共培养拯救出麻疹病毒，对拯救获得的病毒用间接免疫荧光法、传代实验及序列测定进行鉴定分析。结果酶切及测序表明除遗传标签（突变碱基2101 C-A）外其基因序列正确，用免疫荧光技术证实其能与麻疹病毒核衣壳蛋白和磷蛋白单克隆抗体产生特异性反应，所拯救病毒感染 Vero 细胞后可致细胞病变效应，传代实验表明病毒可以稳定感染 Vero 细胞。结论成功构建了稳定的麻疹减毒活疫苗 S191感染性克隆，初步建立了用于麻疹病毒研究的反向遗传学方法，为新型疫苗的研发提供参考资料。
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乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2感染性克隆的构建、鉴定及稳定性分析
目的 构建稳定的乙型脑炎病毒(JEV)疫苗SA14-14-2感染性克隆.方法 用基因重组技术把SA14-14-2全长 cDNA克隆到质粒pACNR中,并以其为模板转录RNA,将RNA电转导入BHK21细胞包装病毒,用蚀斑实验和间接免疫荧光法检测病毒,对病毒进行传代实验及序列分析,并比较恢复病毒和疫苗株在蚀斑大小、神经毒力等方面的差别.结果 酶切及测序表明质粒模板成功构建,用免疫荧光技术检测到恢复病毒蛋白表达,恢复病毒感染BHK21后可致细胞病变效应(CPE),传代实验表明病毒可以稳定感染BHK21细胞,测序表明:除人为引入的突变外(碱基473 A→C)无任何碱基突变,并发现恢复病毒在蚀斑形成、小鼠的神经毒力等特性方面同疫苗株相同.结论 成功构建了稳定的JEV感染性克隆,建立了用于JEV研究的反向遗传学方法,为研究JEV的致病机理、疫苗的减毒机制以及嵌合病毒疫苗的研发奠定基础.
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RNA病毒的反向遗传学操作
RNA病毒的反向遗传学操作是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入的DNA环节,实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作,在深入阐明病毒基因组结构与功能、发展新型病毒载体,尤其在研制筛选候选疫苗株等方面有很好的应用前景.本文就正链及负链RNA病毒的反向遗传学操作及技术应用进行了综述.
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仙台病毒载体的研究与应用进展
仙台病毒(Sendai virus,SeV)属于副粘病毒科呼吸道病毒属,基因组为不分节段的单负链RNA,编码NP,P,M,F,HN,L等11个蛋白.应用反向遗传学构建的仙台病毒载体是新兴的RNA病毒载体,由于其宿主范围广、表达量高、胞质表达、安全性好等诸多优点,目前广泛用于基因治疗药物和疫苗研究.本文从仙台病毒的基因组分子结构、致病性和免疫原性、载体的构建和类型以及其应用等方面进行详细论述.
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人类疾病基因研究
1986年,Duchenne肌营养不良、慢性肉芽肿和视网膜母细胞瘤等疾病基因的相继克隆，标志着人类疾病基因研究进入了“反向遗传学”或“定位克隆”时代。
