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以乙脑减毒活疫苗SA14?14?2为骨架的重组嵌合登革4病毒的构建与鉴定
登革4型病毒近年来在我国东南沿海地区时有流行,威胁人民健康与公共卫生安全.本研究以乙脑减毒活疫苗SA14?14?2为骨架,通过反向遗传学技术构建了携带登革4型病毒主要结构蛋白prM/E基因重组嵌合病毒(ChinDENV4);进一步通过蚀斑、 生长曲线、 动物实验等对其生物学特征进行了鉴定.结果显示,重组嵌合病毒ChinDENV4可高效表达登革4型病毒的结构蛋白,蚀斑大小与亲本株类似;ChinDENV4并能够在BHK?21、C6/36等细胞中高效复制,滴度分别达到1.26×105和1.58×106 PFU/mL.更重要的是,嵌合病毒ChinDENV4在乳鼠模型中的神经毒力显著弱于亲本株.本研究成功构建了乙脑/登革4型嵌合病毒,为下一步四价嵌合登革减毒活疫苗研究奠定了重要基础.
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登革4型病毒Ban18原株及其减毒株的分子特征研究
目的 从分子水平上探讨登革4型病毒Ban18-30减毒株的毒力相关位点和减毒机制.方法 Ban18原株及Ban18-30减毒株在Vero细胞中培养增殖,收集病毒液,经RNA抽提后RT-PCR扩增C、prM、E、NS1和3′、5′端核苷酸片段并测序,比较分析结果,研究两株病毒的分子特征. 结果 RT-PCR成功扩增出目的 片段,对两株病毒部分基因测定序列后进行对比分析,两株病毒间在C111位和E155位各有1个氨基酸残基发生变化,在3′UTR的219位发生核苷酸改变. 结论 从分子水平证明两株病毒确为DEN-4型病毒,某些基因位点的变化与Ban18-30株病毒毒力减弱有关,其中E155位的突变可能关系大.
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我国云南登革4型病毒减毒株生物学特性及全基因组序列分析
目的 对我国云南登革4型病毒分离株(Ban18)及其减毒株(Ban18 HK20和Ban18 HK30)的生物学特性进行分析,测定原株和减毒株的全基因组序列并进行比对,分析与毒力相关的位点.方法 将各毒株在Vero细胞传代后进行空斑形态观察、小鼠脑内致病力和免疫原性检测;减毒株经空斑纯化后,挑选单克隆,检测其小鼠脑内致病力;提取减毒株基因组RNA,RT-PCR法分段扩增其全基因组序列并测序,应用DNAStar软件包进行序列比对分析.结果 Ban18 HK20和Ban18 HK30毒株在Vero细胞上形成的空斑较其原株稍大,但边界较模糊;两个代次的减毒株对KM小鼠不致病,对2～4日龄乳鼠的脑内致病力也明显低于其原株;Ban18原株和Ban18 HK20毒株免疫的小鼠经3个剂量的国际标准株H241株脑内攻击后,均无死亡,但Ban18 HK30毒株与对照组相比,未显示出保护作用;Ban18 HK20毒株的9个克隆株中,3株对乳鼠的脑内致病力低于其他6株克隆株,Ban18 HK30毒株的5个克隆株对乳鼠的脑内致病力无明显差异;减毒株的两个代次病毒与其原株存在3个氨基酸[A→W(C-1 11)、I→T(E-155)、I→L(E-369)]和一个核苷酸[G→A(3'UTR-219)]的共同差异.结论 通过原代地鼠肾细胞传代的两个代次(HK20和HK30)病毒对小鼠的脑内致病力明显减弱,其中Ban18 HK20免疫原性较好,并从空斑克隆中筛选出3株毒力较Ban 18 HK20更低的克隆株;C-111、E-155、E-369和3'UTR-219突变与毒力减弱密切相关.
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登革4型病毒深圳分离株E基因序列测定及其系统发生分析
目的 对深圳市2005年从登革热患者急性期血液中分离到的1株登革病毒进行型别鉴定,从分子水平分析分离株的生物学特征,追踪其可能的地域来源.方法 用C6/36细胞培养增殖病毒株SZ0524,收集病毒液.用逆转录-半套式PCR(RT-semi-nested-PCR)方法和荧光PCR方法对其进行型别鉴定.扩增病毒E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革病毒株进行同源性比较和进化树分析.结果 深圳市登革病毒分离株用4型特异性引物扩增出392bp的特异性条带,荧光PCR进一步证实了分离的病毒株为登革4型病毒.SZ0524与登革病毒4型国际标准株H241株在E基因上核苷酸同源性为99.7%,而与登革病毒1、2、3型国际标准株HAWAII、NGC、H87同源性分别为57.0%、59.2%和56.2%.基因进化树显示SZ0524株与D4-73NIID株和D4-61NIID株亲缘关系近,其次为H241,在进化树的同一分支上,属基因Ⅰ亚型.结论 从分子水平证明从深圳市登革热患者血清中分离到的毒株确为DEN-4型病毒.结合流行病学调查资料,证实此病例为输入性感染病例,该毒株有可能来源于东南亚一带.
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云南登革4型病毒的鉴定及NS1和NS2a基因序列分析
目的 对1989年8月分离自云南省盈江县蚊虫的2株登革病毒进行生物学及分子特征的鉴定,明确这两株病毒的血清型及基因型.方法 蚊虫用BHK21细胞和乳鼠法分离病毒.用间接免疫荧光试验、RT-PCR等方法进行鉴定,并对这两株病毒的分子生物学特征进行分析.结果 从白纹伊蚊和达勒姆阿蚊中各分离到一株病毒,分别命名为M110和M113.这两株病毒对BHK21细胞能产生明显的细胞病交.脑内接种乳鼠4d左右导致乳鼠死亡.该病毒经血凝、血凝抑制和闻接免疫荧光试验提示为黄病毒.分别用黄病毒属特异引物、登革4型病毒NS1和NS2a基因片段特异引物进行RT-PCR扩增、序列测定.证实为登革4型病毒.NS1和NS2a基因序列片段分析表明,M110和M113的NS1核苷酸序列与登革4型病毒基因Ⅰ型的H241株(Y19176)同源性高.分别为99%、98%; NS2a基因片段与H241的核苷酸序列的同源性分别为96.5%、97.1%.结论 从盈江县蚊虫分离到的M110和M113病毒为登革4型病毒基因Ⅰ型,表明云南省西部边境地区在20世纪80年代发生过登革4型病毒的流行.
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云南省登革4型病毒全基因组序列特征研究
目的 阐明云南省2015年5株登革4型病毒(DENV-4)流行株的全基因组序列特征及分子流行病学特点.方法 采用C6/36细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-4的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸和推导氨基酸序列同源性及系统进化分析.结果 从2015年云南省瑞丽市登革热患者血清中分离到5株DENV-4(本地病例2株,来自缅甸腊戍和南坎市输入性病例3株).经RT-PCR和序列测定,获得这5株DENV 4的金基因组序列(10 661 nt),其开放读码框(103-10 264)编码3 386个氯基酸.全基因组或结构蛋白和非结构蛋白基因序列的系统进化和同源性分析表明,云南分离株间高度同源并聚集为一个进化支,并与泰国不同年代DENV-4基因Ⅰ型(G-Ⅰ)流行株具有较近的进化关系和较高的同源性,同属G-Ⅰ.云南株和泰国株均与同基因型的DENV-4原型株(H241,1956年菲律宾)和中国广州1990年B5株亲缘性和同源性都较低.云南株与H241株在结构蛋白或非结构蛋白中分别存在21和45个氨基酸位点差异.结论 首次获得云南省DENV-4分离株的全基因组序列并发现它们与近期东南亚DENV-4 G-Ⅰ流行株亲缘关系较近.首次证实云南省存在DENV-4本地流行,传播来源为相邻缅甸北部边境地区.云南分离株某些氨基酸位点的改变是否与其抗原性和毒力有关尚需进一步研究.
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建国后首次登革热暴发分离的2株登革4型病毒prM和E基因序列测定及其系统发生分析
目的 对建国后1978年广东佛山首次暴发登革热流行时从患者急性期血液中分离到的两株登革4型病毒(78-42、78-56)进行其分子特征研究并了解其可能来源.方法 用Vero细胞培养1978年分离自广东佛山登革热病人的78-42、78-56两病毒株,RNA抽提后RT-PCR法扩增prM、E区基因,克隆至pGEM-T Easy载体后测序;利用DNASTAR软件预测其氨基酸序列并与其他国内外登革4型病毒株序列比较;运用CLUSTALX1.83和MEGA3.1软件绘制系统发生树.结果 78-42、78-56两株高度同源,prM、E基因序列和氨基酸序列与其他登革4型病毒同源性很高并证实为登革4型毒株,与印度尼西亚和马来西亚分离株同属基因ⅡA亚型,核苷酸同源性与印尼ID1973株高.结论 78-42、78-56两新分离病毒株为建国后首次分离到的登革4型毒株,其来源可能来自印度尼西亚.
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我国登革4型病毒广州株基因组非编码区序列测定及分析
目的测定和分析我国登革4型病毒广州(D4-B5)株基因组非编码区(NCR)序列,为探讨其结构特征与功能的关系提供依据.方法从登革4型病毒感染的乳鼠脑中提取总RNA,采用RACE法扩增病毒基因组5'和3'端片段,分别将其克隆至pGEM-T载体,挑取阳性克隆进行序列测定;利用RNAdraw软件对非编码区二级结构进行预测.结果与结论我国登革4型病毒广州株基因组5＇和3＇非编码区长度分别为101 nt和403 nt,具有黄病毒共有的保守序列和二级结构.与登革4型病毒多米尼加分离株比较显示,5＇NCR第57和36位核苷酸的改变对其二级结构有显著的影响;3＇NCR多处核苷酸差异导致两者预测的二级结构差别较大,但均能形成相同的保守结构,它们可能对病毒基因组RNA的复制、组装起重要作用.
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首次从深圳市登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒
目的:对深圳市2005年登革热病原体进行分离鉴定.方法:采用酶链免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法检测登革热疑似患者血清中的特异性IgM和IgC抗体.用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定.用逆转录-套式PCR方法对其进行型别鉴定.结果:从8份标本中成功分离到一株登革病毒,经逆转录-套式PCR方法鉴定为登革4型病毒,将其命名为DEN4-SZ0524.结论:首次从2005年登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒,为进一步研究和控制该地区登革热提供了科学依据.
