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广东省肇庆市2014-2015年登革病毒分子分型及初步溯源研究
目的 了解广东省肇庆市2014-2015年登革病毒(DENV)的基因型别和可能的输入来源.方法 收集登革热临床诊断病例急性期血清,对实时荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测阳性标本进行病毒培养,分离株进行E基因扩增与序列测定,用Mega 5.1软件进行分子分型和系统进化树构建.结果 4 09份样品中147份实时荧光RT-PCR检测阳性(35.94％),其中2014年阳性144份(39.99％),以DENV 1(139/361)为主;2015年阳性3份(6.25％),以DENV 3 (2/48)为主.共获得22株DENV分离株,其中20株为2014年DENV 1型的genotype Ⅰ和Ⅲ,与2013-2014年广州、佛山市分离株核苷酸同源性分别为99.40％ ～ 100.00％和99.20％～100.00％,与新加坡、泰国、马来西亚和印度尼西亚分离株亲缘关系次之;2株为2015年DENV 3的genotypeⅢ,与近年新加坡和印度尼西亚分离株的核苷酸同源性为98.20％ ～99.70％.结论 广东省肇庆市2014年暴发流行的DENV 1为genotype Ⅰ和Ⅲ,可能由广州市和佛山市输入,2015年散发的DENV 3为genotypeⅢ,由佛山市输入,疫情毒株可能源于新加坡、印度尼西亚等东南亚流行株.
关键词： 登革病毒 E基因 实时荧光RT-PCR 序列分析 -
广西北流市分离到基因I型流行性乙型脑炎病毒
目的 从广西流行性乙型脑炎(乙脑)监测点之一的北流市分离乙脑病毒并研究其基因分型.方法 2006年在广西北流市采集蚊虫标本,在C6/36和BHK-21细胞上进行病毒分离,对病毒分离物进行多种虫媒病毒抗体的酶联免疫吸附试验,获得的乙脑病毒进行E基因扩增、测序和基因分型.结果 在北流市采集骚扰阿蚊2588只和三带喙库蚊230只,分61批进行处理,获得3个病毒分离物,酶联免疫吸附试验与乙脑抗体反应,E基因测序后基因分型显示为基因I型乙脑病毒.结论 从广西蚊虫标本分离到基因I型乙脑病毒.
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福建口岸输入登革Ⅰ型病毒E基因序列分析
目的 研究分析福建口岸输入登革Ⅰ型病毒E基因序列,为登革热诊断的分子溯源提供参考.方法 收集2012-2013年福建口岸截获的7例入境Ⅰ型登革热病例资料及血清标本,用C6/36细胞培养分离病毒,提取病毒RNA,用RT-nested-PCR扩增包含E基因全长的核酸片段,扩增产物经纯化、测序,用生物学软件进行DNA序列比对分析.结果 用C6/36细胞从7例登革热病例血清中成功分离出7株登革病毒株,经RT-nested-PCR证实均为DENV-Ⅰ型,构建E基因全长进化树分析发现,分离株与新加坡、越南和菲律宾等地的病毒株同源性高,与病例入境时进行的流行病学调查资料完全吻合.结论 从分子水平证明登革热病例血清中分离到的毒株为DENV-Ⅰ型病毒,结合流行病学调查资料,证实均为输入性感染病例,有可能来源于东南亚一带.
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福建省2012-2014年登革病毒E蛋白基因序列研究
目的 测定分析福建省2012 2014年登革病毒E基因序列,探讨病毒传播来源及基因型.方法 收集福建省2012-2014年登革热患者血清样本33份,RT-PCR法扩增登革病毒E基因,测定基因序列并绘制系统发育树,结合流行病学资料分析.结果 福建省2012-2014年登革热主要来源仍为输入性,可能来源于东南亚国家,以DENV-1和DENV-2基因型为主.基于E基因系统进化分析表明,福建省2012-2014年DENV-1属于Genetype Ⅰ、Genetype Ⅳ和Genetype Ⅴ;DENV-2基因型均为Cosmopolitan(混合型).结论 福建省2012-2014年登革病例仍以输入为主,存在输入引起本地感染的风险,应加强出入境人员的监测工作.
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广州市2010年登革4型病毒的分离及其E基因进化分析
登革病毒(DEN)E蛋白在病毒与宿主细胞融合和诱导机体产生抗体等过程中发挥重要作用[1].本研究通过对分离株E基因全序列测定,从分子水平确定其型别,并与广州市历年同型DEN流行株及相关国际流行株进行同源性比较,构建系统进化树,追踪其可能输入来源.
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广州市2011年登革病毒流行状况及E基因进化特征分析
目的 了解2011年广州市登革热的流行情况,分析新分离毒株的E基因分子特征.方法 收集2011年广州市登革热的流行病学资料和血清标本.采用荧光定量PCR检测并确定血清型,C6/36细胞进行病毒分离,测定新分离毒株的E基因序列,利用Mega 4.0软件分析.结果 2011年广州市登革热发病高峰在9-11月.在患者血清中检测出登革热病毒1、2、4型,分离出5株登革热1型毒株.在基因型上,4株属于亚洲型,1株属于美洲/非洲型.结论 广州市登革病毒与东南亚地区的毒株有较高同源性,且存在登革热暴发的潜在风险,该病毒在广州市可能已出现本地化趋势.
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广州市2009年新出现登革3型病毒的分子流行病学分析
目的 对广州市2009年新出现的3型登革病毒(DEN)株的E基因进行RT-PCR扩增和序列测定,探讨其来源及基因型.方法 收集广州市2009年登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离DEN,RT-PCR扩增病毒全长E基因,测序并绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析.结果 2009年采集的19份患者血清标本中,分离到7株3型DEN株,RT-PCR扩增后测序获得E基因序列,7株DEN3病毒E基因均由1479个碱基组成,编码493个氨基酸,基因序列未见插入或缺失,分析发现7株病毒来自两个不同的亚型:09/GZ/1081、09/GZ/1483和09/GZ/10806属于东南亚/南太平洋型,09/GZ/10616、09/GZ/11144、09/GZ/11194和09/GZ/13105属于印度次大陆型,各亚型群内毒株序列同源性较高.结论 广州市2009年DEN3为输入性,分属两个基因型.
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云南省1977-2010年流行性乙型脑炎病毒分子流行病学研究
目的 阐明1977-2010年分离自云南的63株流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的基因型和分子流行病学特点.方法 病毒株常规接种乳小白鼠,取发病濒死的乳鼠脑组织经研磨制成上清液,提取病毒核酸,通过RT-PCR扩增乙脑病毒E基因序列,采用ClustalX、DNAstar和Mega 5.0等生物学软件进行核苷酸和氨基酸序列分析及系统进化树分析.结果 云南乙脑病毒分离株均可引起乳鼠发病和死亡.经RT-PCR和序列测定获得63株乙脑病毒的E基因序列,进化树和同源性分析表明,47株属基因1型,16株为基因3型.基因1型可分为2个进化群,其中云南早的基因1型分离株(M28,1977;BN82215,1982)与泰国早期基因1型分离株(U70416,1982;DQ084229,年代不详)同处一个进化群;2007-2010年基因1型分离株分布于两个次级进化分支;16株基因3型分布于3个进化群中,其中20世纪70-90年代分离株分布于两个进化群,2004年分离株处于另一进化群.此外,无论基因1或3型乙脑病毒的抗原性、致病性和毒力等主要氨基酸位点均未发生明显改变.结论 云南省存在基因1和3型乙脑病毒流行,1型为近期主要流行型.云南省不同年代和地域的乙脑病毒分离株存在明显差异并具有遗传多样性特点.本研究还提示基因1型乙脑病毒可能起源于中国云南省及相邻东南亚地区.
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广州市2001-2015年登革病毒2型E基因进化分析
目的 了解2001-2015年广州市登革病毒2型(DENV2)的流行情况;通过对分离DENV2 E基因的进化树和分子钟分析,掌握毒株的进化情况和趋势.方法 将登革热确诊病例的血清用荧光PCR进行检测,DENV阳性血清用C6/36细胞进行病毒分离,测定分离毒株的E基因序列,利用Mega 4.0软件构建进化树,采用BEASTvl.8.2绘制分子进化钟.结果 2001-2015年共分离到26株DENV2,从基因型上分类属于全球型和亚洲1型,并与东南亚地区分离到的毒株相似率较高;BEASTv1.8.2计算出广州市DENV2全球型在46年前和35年前进一步出现亚型的分化,广州市DENV2的平均变异率为每年每位点7.1×104.结论 广州市DENV2与东南亚地区的毒株有较高同源性和进化上的联系,广州市DENV的输入压力较大,存在重症登革热暴发的潜在风险.流行于广州市的全球型DENV2可能存在2个不同输入来源,广州市DENV2的变异率与周边地区基本持平.
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2017年Ⅱ型登革病毒汕头流行株的E基因序列分析
目的 阐明2017年汕头市2型登革流行株的基因型别,为其传播途径的分子流行病学研究提供依据. 方法 采集2017年汕头市疑似登革热患者血清标本,进行登革热病毒检测,阳性者进行全长E基因PCR扩增,对扩增产物进行序列测定,采用生物信息学软件Sequencher5.1、BioEdit和Mega6.0进行序列的比对分析并构建系统进化树. 结果 有4例血清标本检出登革热病毒2型核酸,其中2例的标本扩增出E基因全长序列(1 485 bp),两者序列相似度100％,判定是由同一株病毒引起的感染.该流行株属于Cosmopolitan基因亚型,与东南亚毒株具有较高相关性.氨基酸序列分析显示该毒株E蛋白毒力位点的氨基酸为E126-E、E383～385-E-P-G、E71-A和E390-S. 结论 汕头市2017年登革病毒流行株可能为东南亚毒株并发生一定变异,其E蛋白毒力位点的氨基酸为E126-E、E383～385-E-P-G、E71-A和E390-S,属于弱毒株.
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浙江省2013年输入性登革热病例病原分子溯源
目的 对2013年浙江省登革热病例进行实验室确诊与病原的分子溯源.方法 对患者血清样本同时进行登革热病毒IgM抗体和核酸检测及病毒分离,阳性分离株采用RT-PCR方法扩增E基因,进行核苷酸序列测定和同源性与进化分析.结果 18例患者发病前均有在境外登革热流行区暴露史,从患者18份血清样本中检测到登革热病毒IgM抗体阳性15份(83.3％),核酸阳性8份(44.4％),分离到登革热1型病毒6株,4型1株.6株登革热1型株之间E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9％～99.7％和96.8％～100％,与浙江省2004年登革热1型株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为91.4％～98.5％和96.6％～99.0％;E基因进化树显示,登革热1型株位于GⅠ、GⅣ和GⅤ基因亚型上,登革热4型株位于GⅠ亚型上,2013年7株登革热病毒与浙江省2004-2009年登革热病毒之间亲缘关系较远.结论 证实2013年浙江省登革热病例均为输入性,输入国为菲律宾、安哥拉、斯里兰卡和巴西等;登革热1型株基因亚型分别为亚洲型、南太平洋型和美洲月非洲型,登革热4型株为东南亚型;登革热4型病毒为浙江省首次分离.
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登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究
目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因,从分子水平分析流行毒株的生物学特征,追踪传染源,为疾病的预防控制提供实验室依据.方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸,并用C6/36和BHK-21细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定,并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析.结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸,并分离到登革2型病毒;浙江省登革2型病毒分离株(ZJ/01/04)与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian/10/99株和Saudi/92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97.1%、99.2%和99.6%,而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68.7%、66.9%和63.6%.基因进化树显示ZJ/01/04分离株与Saudi/92株亲缘关系近,在进化树的同一分支上.结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起,该毒株有可能来源于沙特阿拉伯.
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浙江省衢州市1例输入性登革热病例分子流行病学研究
目的 调查浙江省衢州市1例登革热输入性病例流行病学特征及病原体分子溯源,为登革热的防控提供依据.方法 对2017年输入性登革热病例进行流行病学调查,采集病例血清进行登革热病毒核酸和抗体检测,提取病毒核酸后扩增E基因并测序,利用生物信息学软件进行多序列比对并构建进化树.结果 该病例登革热病毒核酸及IgM抗体检测结果均为阳性,基因序列比对及进化分析,病毒株为登革热病毒1型Ⅰ亚型,与东南亚病毒株(登录号KY586429.1、KJ806941.2)亲缘关系近,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1％和99.7％.结论 衢州市登革热病毒1型病例可能为来自东南亚的1例输入性病例.
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台州市本地感染登革病毒分子分型及溯源分析
目的 对2016年台州市本地暴发的登革热病例进行实验室检测与溯源分析.方法 采集3例患者急性期血清进行抗原、抗体和核酸检测,并用C6/36细胞分离培养登革病毒.用RT-PCR方法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统进化树.结果 从患者血清中检测到登革Ⅰ型病毒核酸、IgM抗体和NS1抗原.成功分离到3株Ⅰ型登革病毒株,这3株病毒在同一进化分支上,属于Ⅰ型登革病毒中的Genotype Ⅰ亚型,核苷酸同源性均为99.87％,氨基酸同源性为99.6％ ～ 99.8％.结论 浙江省台州市本次登革热本地暴发病例可能由广东或东南亚输入而来.
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中国分离乙脑病毒与灭活疫苗株(P3株)E基因差异分析
目的分析我国近年来从蚊虫及患者标本中分离的乙脑病毒与灭活疫苗株(P3株)之间在E基因区段核苷酸及氨基酸差异.方法从GenBank中获取相应乙脑病毒株E基因区段核苷酸序列,通过Clustal X(1.8)、DNASTAR、GENEDOC(3.2)等生物学软件进行分析.结果P3株与福建分离株之间核苷酸同源性在98.3%～98.5%之间、氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间;P3株与上海分离株之间核苷酸同源性在88.0%～88.5%之间、氨基酸同源性在98.0%～98.4%之间.E基因区段500个氨基酸中P3株与所有新分离乙脑病毒株之间共存在19个位点的差异,其中在E-76、E-306、E-408处所有新分离毒株与P3株存在共同的差异;在E-160、E-487处福建分离株与P3株存在共同差异;上海分离株与P3株在E-129、E-222、E-227、E-366存在共同差异.结论上海蚊虫中分离的Ⅰ型乙脑病毒和福建省脑炎患者中分离的Ⅲ型乙脑病毒与P3株在E基因的部分氨基酸位点存在差异,但均不处在影响病毒生物学特性的关键位点.
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两株登革2型病毒E基因重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较
目的 用含登革2型病毒(Dengue type 2 virus,DEN2)B株和NGC株E基因部分序列pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 用两株含DEN2 E基因部分序列(1～476 bp)的pcDNA3.1重组质粒与含有佐剂的重组质粒共同免疫BALB/c小鼠,初次免疫后第14天、28天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第14、28、42、70和98天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血浆特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异性抗体水平.结果 不同DEN2毒株E基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类抗体的产生存在差异,B株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DEN2两毒株E基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.
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重庆流行性乙型脑炎病毒分离株CQ11-66在PrM/C及E基因区的分子特征
目的 分析重庆地区儿童流行性乙型脑炎(简称乙脑)病毒分离株CQ11-66在PrM/C及E基因区的分子特征.方法 采集重庆医科大学附属儿童医院感染消化科诊断的流行性乙脑患者血液及脑脊液标本,通过接种BHK-21细胞检测并分离乙脑病毒,并对其PrM/C及E基因区测序.使用Clustal X(1.8)、MEGA5等生物学软件进行核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化分析.结果 本研究仅从儿童乙脑患者脑脊液标本中分离到1株乙脑病毒,命名为CQ11-66.CQ11-66和其他国家及地区的乙脑病毒分离株相比,PrM/C基因区总体核苷酸及氨基酸序列同源性分别为74.8％～97.4％及85.6％～98.7％,而E基因区总体核苷酸及氨基酸序列同源性分别为81.6％ ～ 99.6％及94.8％ ～99.6％；CQ11-66株与福建省乙脑病毒人分离株相比较,在PrM/C、E基因核苷酸及氨基酸序列同源性均很高.基于PrM/C及E基因区核苷酸序列进行系统进化分析,CQ11-66株属于基因Ⅲ型.结论 在重庆市儿童乙脑患者标本中分离到1株乙脑病毒CQ11-66,CQ11-66株在PrM/C和F基因区核苷酸序列和氨基酸序列同其他乙脑病毒分离株存在一定的差异,且系统进化分析显示CQ11-66株属于乙脑病毒基因Ⅲ型.
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登革2型病毒海南分离株全长E基因的测定与分析
目的测定我国登革2型病毒海南分离株E基因的全序列,并分析其病毒学特性和分子进化特征. 方法运用RT-PCR法扩增我国登革2型病毒海南分离株(D2V-HN89)E基因,测序并用计算机分析序列,作毒株感染细胞及乳小白鼠试验. 结果 D2V-HN89株E基因核苷酸全长1?464bp,核苷酸和氨基酸序列与D2V-NGC株的同源性分别为95%和98%,系统树分析显示其与登革2型牙买加株及登革2型巴西90株的亲缘关系近.D2V-HN89株的细胞病变效应与D2V-NGC株相同,但对乳小白鼠神经毒力较弱. 结论 D2V-HN89株的E基因区有缺失,该流行毒株可能来源于牙买加或巴西登革热流行区.
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我国首次分离到基因Ⅰ型乙型脑炎病毒
目的对新分离乙型脑炎病毒鉴定,了解病毒E基因区段的氨基酸序列特征及基因分型. 方法 2001年在上海市采集蚊虫标本,用组织培养的方法分离到7株病毒.进行病毒一般生物学鉴定,对病毒PrM和E基因区段约2000nt进行了扩增、克隆、测序.应用Clustal X软件做碱基配对和比较分析,种系发生采用PHYLIP软件包分析. 结果 7株病毒可以引起BHK-21细胞规律病变,病变时间为60 h.乳鼠脑内接种病毒后72 h死亡.所有新分离病毒与标准乙型脑炎病毒抗体阳性反应.用病毒PrM区段(456～695位核苷酸)进行的基因分型分析,新分离的7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒.以减毒活疫苗株SA14-14-2为标准,对7株病毒的E基因区段进行分析,7株病毒之间核苷酸同源性在97.7%以上,氨基酸同源性在99.2%以上;7株病毒与疫苗株SA14-14-2核苷酸差异在12.2%左右,氨基酸差异在2.8%～3.2%之间,共有14个共同的氨基酸位点差异. 结论 2001年在上海采集的蚊虫中新分离的7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,为我国的首次报道.
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广州4株登革1型病毒E基因的全序列测定和分子进化分析
目的 通过对广州市不同年份分离的4株登革1型病毒(DEN-1)蛋白E基因进行全序列测定及分子进化分析,了解各流行株之间的遗传差异及进化关系,追踪其可能的传染来源.方法 应用RT-PCR技术分别扩增各株病毒的蛋白E基因,克隆到pGEM-T Easy载体,转化DH5α宿主菌,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定.测序结果与国内外流行株进行同源性比较和毒力位点分析,并绘制基因系统发生树.结果 4株DEN-1病毒E基因序列长度均为1485 bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性为91%～98%,推导的氨基酸序列同源性为96.0%～99.2%.广州1995年流行的DEN-1和2002、2004、2006年流行株的毒力位点氨基酸存在差异.结论 通过对登革1型病毒E基因的进化分析,GZ01/95、GZ01/02和GZ01/04这3株同属于基因型Ⅳ,而GZ17/06属于基因型Ⅰ.1995年广州地区流行的DEN-1可能来源于印度尼西亚,而2002和2004年的流行可能与澳大利亚流行株有关.2006年广州又出现的DEN-1可能与泰国2002年的流行株输入有关.
