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丙型肝炎病毒JFH1适应性突变株全长cDNA的构建
目的 构建丙型肝炎病毒JFH1全长cDNA克隆,获取突变位点信息. 方法 应用长片段RT长片段RT-PCR技术对不同时期传代的JFH1病毒株进行分段扩增. 通过共同酶切位点连接成9. 7Kb从DNA片段,与pBlueScript2ks( +)形成克隆载体,进一步测序分析. 结果 获取丙型肝炎病毒JFH1系列适应性突变株全长cDNA模板,共发现23个单核苷酸突变. 结论 丙型肝炎病毒JFH1 系列存在单核苷酸突变位点,为进一步了解HCV JFH1适应性突变位点功能奠定基础.
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HCV2a(JFH1)NS5A蛋白在原核和真核细胞中的表达、鉴定及分析
目的 在原核与真核细胞中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)2a型JFH1(japanese fulminant hepatitis 1)株NS5A蛋白,分析JFH1 NS5A蛋白与其它基因型NS5A蛋白间的差异,为进一步研究NS5A蛋白在HCV病毒复制中的作用奠定基础.方法 PCR特异扩增JFH1 NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1载体中,构建JFH1 NS5A的原核和真核重组表达质粒pET-JFH1 NS5A和pEGFP-JFH1 NS5A.将pET-JFH1 NS5A转化大肠杆菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1 NS5A转染HEK 293T细胞,在原核与真核系统中进行表达,并以SDS-PAGE、荧光显微术和Western blot方法检测.利用PubMed BLAST软件对JFH1与HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白间的同源性进行了分析.结果 酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1 NS5A.SDS-PAGE电泳检测到融合蛋白在原核细胞中的表达,荧光显微镜观察和Western blot检测到了GFP-JFH1 NS5A融合蛋白在HEK 293T细胞中表达.BLAST分析显示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分别为57%、60%、68%和74%.结论 JFH1 NS5A蛋白在原核与真核细胞中表达成功,为研究HCV NS5A在JFH1株病毒高效复制中的作用提供了材料.
