首页 > 文献资料
-
线粒体DNA与人精子活力间的相关性分析
目的探讨线粒体DNA与人精子活力间的关系. 方法用长链PCR技术,对60例精子活力正常和40例精子活力异常不育患者的精子线粒体DNA(mtDNA)进行了多重缺失的分析. 结果两组不育患者中共有8例具有mtDNA的多重缺失(其中精子活力正常不育患者6名,精子活力异常不育患者2名),但缺失型mtDNA(S5除外)在总mtDNA中所占比例很小(0.16%～1.85%),1例精子活力正常的不育患者(S5)具有2.6kb的缺失型mtDNA,且缺失型mtDNA占总mtDNA的91.02%,其序列分析发现mtDNA编码区域大部分缺失. 结论精子活力与mtDNA的多重缺失间无相关性.
-
GJB2全序列长链PCR和琼脂糖凝胶电泳方法研究
目的：探讨GJB2全序列长链PCR方法和琼脂糖凝胶电泳方法，以及影响长链PCR和电泳结果的可能因素。方法应用Primer Premier 5.0软件和Oligo 6 Demo软件针对GJB2全序列设计引物，应用DNA聚合酶KOD FX Neo试剂盒进行两步法长链PCR扩增，调整加入DNA模板量、PCR延伸时间、循环次数等影响PCR产物量，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物长度和量，调整加样槽的宽度、加样量、电泳电压、电流、电泳时间得到清晰条带，若PCR产物存在大片段碱基插入或缺失，用限制性内切酶BamHI进行内切酶反应，初步判断插入或缺失的大致位置。结果正向引物F：5’-AGATCGGGACCTCGAAGGGGACTTG-3’；反向引物R：5’-AGGTGGGCACGGGGTTAGGTAGAAA-3’，扩增片段长5887 bp。长链PCR条件为：50μl的反应体系中加入2μl（约40 ng）的基因组DNA，预变性94℃2分钟，变性98℃10秒，68℃延伸5分钟，共32个循环。电泳条件为：加样槽5 mm宽，每槽加样0.8μl PCR产物，电泳电压50 V，电流50 mA，电泳时间140分钟。结论应用DNA聚合酶KOD FX Neo试剂盒进行两步法长链PCR，可进行GJB2全序列扩增，影响PCR的可能因素为引物、DNA模板的质和量、延伸时间、循环次数等。0.8%琼脂糖凝胶电泳可获得较好的分离效果，影响电泳可能的因素为加样槽宽度、加样量、电泳电压、电流、电泳时间等。
-
以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA
目的 以长链PCR(Long-PCR)技术为基础,应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒(JEV)全长基因组.方法 根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物,分别扩增JEV SA14-14-2株的5'和3'半长分子,在5'端上游引物中引入T7启动子核心序列.利用细胞培养增殖病毒,提取病毒RNA,逆转录后采用Long PCR方法得到JEV的5'和3'两个半长分子,在此基础上进行融合PCR,得到JEV全长cDNA分子,克隆入pGEM T-easy载体,酶切鉴定并测序.结果 扩增出均6 000 bp的JEV的5'和3'两个半长分子及约11 000 bp的全长cDNA片段,其二级结构丰富的非编码区未发生缺失.JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性高达99%,其氨基酸序列同源性高达96.3%.其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较,核苷酸序列同源性高达98%～99%,氨基酸序列也未出现较大差异.结论 已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组,为进一步构建感染性克隆奠定了基础.
-
长链PCR技术研究进展
长链PCR(long PCR)技术是将传统DNA聚合酶与具有3′-5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶混合,利用前者较强的延伸能力和后者的校正功能,通过优化反应液组成及热循环条件,能够扩增出长达40kb的特异产物,在病毒基因组研究及基因检测等方面显示出很好的应用前景.本文就长链PCR技术的原理、反应条件的优化及技术应用进行了综述.
-
基于pJFH-1的HCV全基因组扩增方法的建立
目的 基于pJFH-1建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方法.方法 以pJFH-1为测试模板,通过优化PCR扩增中各个重要环节,包括引物的选择、甘油和/或DMSO适浓度的筛选、循环条件的摸索等,建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方案.结果 高Tm值(＞65 ℃)的引物更有利于HCV全基因组的扩增;5%、10%甘油或5% DMSO可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率,且甘油的促进作用优于DMSO;双温法较三温法能获得更高产量的PCR产物.结论 通过优化长链PCR反应体系及条件,成功实现HCV基因全长的扩增.
-
一个色素失禁症家系的NEMO基因和假基因△NEMO缺失突变分析
目的 用长链聚合酶链反应进行检测家族性色素失禁症(incontinentia pigmenti,IP)患者的NEMO基因的缺失突变.方法 收集一色素失禁症家系的临床资料,选取NEMO基因特异引物In2/ff3R和假基因△NEMO的特异引物Rev-2/JF3R,采用长链聚合酶链反应对家系内成员NEMO基因和假基因△NEMO的缺失位点进行检测,同时对80名无血缘关系健康对照者的该位点进行同样检测.结果 所有患者皆有NEMO基因和假基因△NEMO基因共有序列NEMO△4-10缺失,而在家系内非患者以及80名正常对照者中均未发现NEMO基因和假基因△NEMO的共有序列NEMO4△-10缺失.结论 该家系为一个典型遗传早现现象的IP家系,NEMO基因和△NEMO的缺失突变导致其发病.长链PCR扩增技术可用于检测NEMO基因的缺失突变,对于遗传咨询具有一定的应用价值.
-
长链PCR技术评价60Co-γ射线灭活病毒的研究
目的 探讨用长链PCR技术评价60Co-γ射线辐照灭活伪狂犬病毒(pseudorabies virusPRV),后残余病毒感染性的可行性.方法 针对PRV糖蛋白gD基因前后的保守区设计预计产物长短不一的5对引物,用PCR扩增经不同剂量60Co-γ射线照射后的PRV核酸,并同时以细胞感染法做平行对照.结果 60Co-γ射线辐射对PRV核酸的破坏有剂量依赖性,随着60Co-γ射线剂量的增加,PRV核酸被破坏程度增加,剂量≥20kGy时完全被灭活.5条不同长度PCR扩增产物中,只有长片段3.9kb的检出与细胞培养结果一致.结论 γ射线对PRV核酸的损伤程度随γ射线剂量增加而增大;用长链PCR(3.9kb)来评价经60Co-γ射线辐照灭活病毒后残余病毒的感染性是可行的.
-
结节性硬化症TSC1/TSC2基因突变的高通量测序快速诊断
目的 建立结节性硬化症TSC1/TSC2基因高通量测序技术以快速准确检测结节性硬化的TSC基因突变.方法 对10例结节性硬化症患者及10例正常对照进行研究,利用长链PCR方法扩增TSC1及TSC2基因所有外显子区域,运用Ion PGMTM平台进行二代测序并运用常规测序验证.结果 设计引物对TSC1及TSC2基因特异性扩增出7个长片段产物,产物长度介于13 kb～15 kb间;运用二代测序技术快速鉴定出10个致病突变,其中,7个突变位于TSC2基因,3个突变位于TSC1基因;所有突变经常规Sanger测序验证,结果一致.结论 高通量二代测序技术可快速可靠诊断结节性硬化症TSC1、TSC2基因突变.
