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应用CRISPR-CAS9技术制备miR-155基因敲除小鼠
目的：探讨利用typeⅡbacterial CRISPR/CAS9系统构建miR RNA-155基因敲除小鼠的可行性。
方法：首先，利用软件设计构建识别靶定靶序列的sgRNA，构建致靶基因切割的CRISPR/Cas9载体质粒；然后体外鉴定sgRNA/Cas9的活性检测；设计构建基因敲进的打靶载体；体外转录sgRNA/Cas9 mRNA；小鼠受精卵注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；后miR-155基因敲除F0代C57/BL6小鼠的可遗传性检测，并剪鼠尾提DNA进行鉴定。 -
基于质粒的转基因小鼠致突变检测模型的研究进展
自1980年底,美国Yale大学的Gordon等[1]首次用显微注射法将含有疮疹病毒和SV40 DNA片段的重组质粒导入小鼠受精卵的雄性原核中,成功地建立了世界上第一个转基因动物模型以来,转基因动物的研究已逐步渗透到生命科学的各个领域,并已开始在毒理学中得到应用.由于从动物基因组中能比较容易地重新分离转入的外源基因,并对其突变进行精细的分析(如测序、确定突变类型和突变谱等),因此应用转基因动物研究系统,不仅为突变机理的研究提供了直接的证据,也可以从整体水平上研究突变的组织特异性、突变与表达时间及其与细胞增殖的关系、突变与癌变的相互关系等,并能在同一动物体内进行基因突变和染色体畸变等多个遗传学终点的研究.可以说转基因动物是目前研究体内基因突变唯一可行而有效的四维系统.
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肌醇多磷酸5磷酸酶PIPP在小鼠受精卵内对细胞周期蛋白Cdc2的影响
目的 研究脯氨酸丰富的肌醇多磷酸5磷酸酶(PIPP)在小鼠1-细胞期胚胎中的定位以及它对Cdc2在Tyr15位点磷酸化的调节作用.方法 提取质粒、酶切鉴定并转染PEFBOS PIPP质粒以及空载体PEFBOS vector到小鼠受精卵,用免疫荧光染色检测PIPP的定位,Western blot检测PIPP对Cdc2在Tyr15位点磷酸化的影响.结果 PIPP的定位在小鼠受精卵有丝分裂过程中不断变化,并且PIPP在小鼠受精卵中的过度表达增加了Cdc2在Tyr15位点的磷酸化.结论 PIPP存在于小鼠受精卵中并通过调节Cdc2的磷酸化参与小鼠受精卵的有丝分裂过程.
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HA-PIPPH557A对小鼠受精卵卵裂的影响
目的 研究脯氨酸丰富的肌醇多磷酸5-磷酸酶(PIPP)在组氨酸557位点突变为丙氨酸时PIPPH557A对小鼠受精卵卵裂的调节作用.方法 将HA-PIPPH557A重组质粒转染到小鼠受精卵中,用免疫荧光染色法检测HA-PIPPH557A对小鼠受精卵卵裂的影响.然后使用相差显微镜观察并计数HA-PIPPH557A对受精卵卵裂率的影响.结果 HA-PIPPH557A在小鼠受精卵的有丝分裂过程中对卵裂的调节与PIPP的作用相反.并且他们之间的比较具有显著意义(P<0.001).结论 PIPPH557A在小鼠受精卵中通过调节PIPP的活性作用干扰受精卵卵裂.
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人卵巢 cDNA 文库中与蛋白激酶 Wee1B 相互作用的候选分子的筛选及其调控作用
目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶 Wee1B 相互作用的新候选分子，并用生物信息学方法分析其与 Wee1B 相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以 pcDNA3.1／V5 His TOPO Wee1B WT 质粒为模板构建 pGBKT7 Wee1B 诱饵质粒；制备酵母感受态细胞，将诱饵质粒 pGBKT7 Wee1B 转化酵母感受态细胞后分别接种 SD／Trp （SDO）、SD／Trp／XαGal （SDO／X）和 SD／Trp／XαGal／AbA plates （SDO／X／A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力，利用 Western blotting 法检测 pGBKT7 Wee1B 在酵母中的表达情况；将含有 pGBKT7 Wee1B 的酵母感受态细胞与人卵巢 cDNA 文库相融合，利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定，终再经酵母重新转化验证。在 GenBank 中对其进行BLAST 分析，根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析， pGBKT7 Wee1B 诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在 SDO／X／A 平皿上无克隆。将 pGBKT7 Wee1B 和 pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中，菌液接种于 SDO 平皿，2个 SDO 平皿上克隆都均匀生长。从工作板 SDO 和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养，裂解细胞提取蛋白，Western blotting 法检测示 pGBKT7 Wee1B 对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢 cDNA 文库融合，PCR 验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经 BLAST 分析筛选出9个与 Wee1B 蛋白激酶存在相互作用的蛋白，生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢 cDNA 文库中筛选出9个与 Wee1B 蛋白激酶相互作用的蛋白，这些筛选蛋白可能通过与 Wee1B 相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。
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蛋白激酶A对CDC25B蛋白S149与S321位点磷酸化的修饰抑制小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂
在小鼠1-细胞期受精卵,蛋白激酶A (protein kinase A,PKA)可通过磷酸化细胞分裂周期25B (cell division cycle 25B,CDC25B)的321位Ser引起受精卵分裂阻滞.本文旨在研究PKA对CDC25B 149位点Ser的磷酸化对小鼠受精卵发育的影响,及其与321位点的关系.质粒pBSK-CDC25B-WT (野生型)、pBSK-CDC25B-S149A (149位Ser突变成Ala)、pBSK-CDC25B-S321A (321位Ser突变成Ala)、pBSK-CDC25B-S 149A/S321A (149位和321位Ser联合突变成Ala)体外转录成mRNAs;显微注射入小鼠S期受精卵中,在PKA抑制剂H-89预处理的M16培养基中培养,观察其对受精卵发育、有丝分裂成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)活性及CDC2-Tyrl5磷酸化状态的影响.结果显示,H-89呈剂量(0～50 μmol/L)依赖性的方式加速小鼠受精卵卵裂.然后选择卵裂率接近100％、H-89 (40 μmol/L)培养的小鼠受精卵,与对照组相比,CDC25B各种mRNAs注射组受精卵卵裂率明显增高,MPF活性提前达到高峰；CDC2-Tyrl5磷酸化状态和MPF活性变化相一致,以上结果说明,CDC25B蛋白的149位Ser也是PKA在体内调控CDC25B的重要靶点.因此在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠CDC25B蛋白S149位点与S321位点的磷酸化修饰可能是控制受精卵G2/M转换的重要方式.
关键词： 细胞分裂周期25B 蛋白激酶A 有丝分裂成熟促进因子 H-89 小鼠受精卵 -
WEE1B和CDC25B蛋白核浆转位调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂进程
目的 通过观察内外源性蛋白激酶WEE1B和蛋白磷酸酶CDC25B在小鼠1-细胞期受精卵中不同细胞时期的定位,为深入研究WEE1B和CDC25B的核浆转位机制奠定基础.方法 对小鼠超排卵获得各期受精卵后,免疫荧光观察各期受精卵内源性WEE1B和CDC25B蛋白定位;将pEGFP-CDC25B-WT和pDsRED2-N 1-WEE1B-RFP融合质粒显微注入G1期受精卵中,观察各组小鼠1-细胞期受精卵中外源性WEE1B和CDC25B蛋白亚细胞定位.结果 在小鼠1-细胞期受精卵G2/M期转换过程中,WEE1B向细胞浆转位和CDC25B向细胞核转位.结论 WEE1B和CDC25B在小鼠受精卵G2/M转换过程中存在核浆转位的动态平衡,本研究对阐明WEE1B和CDC25B调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程和生殖机理具有十分重要意义.
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Girdin蛋白在小鼠受精卵微丝聚集调控作用的初步研究
目的:探讨Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期发育微丝聚集中的作用.方法:采用免疫荧光染色观察Girdin蛋白和F-actin在小鼠受精卵中的共定位情况.激光共聚焦显微镜观察Girdin表达敲低后小鼠受精卵分裂形态及分裂率.结果:在小鼠受精卵中存在Girdin蛋白并且Girdin蛋白与F-actin存在共定位.敲低Girdin蛋白的表达,小鼠受精卵出现不规则分裂,10 μmol/LGirdin siRNA处理组小鼠受精卵有28.93％到达2-细胞期,而注射20 μmol/L Girdin siRNA组小鼠受精卵只有15.1％到达2-细胞期.并且Girdin表达敲低的受精卵微丝不能正确聚集.结论:Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期分裂微丝聚集中发挥作用.
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14-3-3ε调节小鼠受精卵纺锤体组装
目的:研究14-3-3ε蛋白调节小鼠受精卵纺锤体组装的作用.方法:采用间接免疫荧光实验检测1-细胞期受精卵14-3-3ε和α-微管蛋白的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsiRNA注射入1-细胞期受精卵,观察小鼠受精卵纺锤体形态及检测Polo样激酶1(Plk1)的活性.结果:14-3-3ε和α-微管蛋白在G1期、S期和G2期卵中主要共定位于细胞质,M期卵14-3-3ε主要位于细胞质皮质.小鼠受精卵注射14-3-3ε siRNA后导致异常形态纺锤体形成及Plk1活性下降.结论:14-3-3ε蛋白在调节小鼠受精卵纺锤体组装中发挥重要作用.
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CDC25B蛋白S149/S321位点突变对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响
目的:研究小鼠CDC25B蛋白S149位点对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响及S149位点与S321位点的关系.方法:构建pBSK-CDC25B-S 149A和pBSK-CDC25B-S149A/S321A突变体,体外转录成mRNA;采用小鼠超排卵技术取G1期受精卵,显微注射CDC25B-WT-mRNA和突变CDC25B-S149A-mRNA、CDC25B-S 149A/S321A-mRNA,观察其对受精卵发育、M期促进因子(MPF)活性及CDC2-pTyr 15磷酸化状态的影响.结果:CDC25B-S149A-mRNA注射组受精卵卵裂率明显高于CDC25B-WT-mRNA注射组,MPF活性提前1h达到高峰；而联合突变体CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组卵裂率又显著高于CDC25B-S149A-mRNA注射组.结论:在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,蛋白激酶A(PKA)对小鼠CDC25B蛋白S149位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式,并且S149位点与S321位点可能具有协同作用.
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FLAG-PIPPH557A在小鼠1-细胞期受精卵中对PKB/Akt表达的调节作用
目的:研究富舍脯氨酸的肌醇多磷酸5-磷酸酶(proline-rich inositol polyphosphate 5phosphatase,PIPP)在组氨酸557位点突变为丙氨酸(FLAG-PIPP<'H557A>)时对小鼠受精卵中磷酸化苏氨酸蛋白激酶(pAkt)的影响.方法:将FLAG-PIPP<'H557A>、FLAG-PIPP以及FLAG vector重组质粒转染到小鼠受精卵,用蛋白印记、免疫荧光染色以及活性检测方法分析FLAG-PIPP<'H557A>对小鼠受精卵中丝氨酸(Ser)473位点磷酸化的苏氨酸蛋白激酶(pAkt Ser473)表达、定位以及活性的影响.结果:FLAG-PIPP<'H557A>在小鼠受精卵中对pAkt Ser473的表达和活性的调节作用明显低于FLAGPIPP的作用,两者间有显著差异(p<0.001);而且在小鼠受精卵中FLAG-PIPPH557A不能调节pAktSer473在细胞膜的定位.结论:PIPP<'H557A>在小鼠1-细胞期受精卵中可以通过改变PIPP的活性,影响pAkt Ser473的表达、定位以及活性.
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Aurora激酶A、B在小鼠受精卵第一次有丝分裂进程中的表达与定位
目的:研究Aurora激酶A(AURKA)、Aurora激酶B(AURKB)在小鼠受精卵第一次有丝分裂进程中的表达与亚细胞定位.方法:分别利用实时荧光定量PCR和Western blotting法从mRNA和蛋白水平上检测AURKA、AURKB在小鼠受精卵第一次有丝分裂进程中的表达规律,并用间接免疫荧光法观察AURKA/B蛋白在各时相的细胞定位.结果:AURKA、AURKB在受精卵的G2、M期呈高表达,G1、S期呈低表达,AURKA/B蛋白主要定位于胚胎的细胞质和细胞核中,但细节上各有特点.结论:AURKA、AURKB在小鼠受精卵第一次有丝分裂进程各期呈时空特异性表达,提示其对小鼠早期胚胎发育过程发挥重要的调控作用.
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蛋白激酶B对小鼠1-细胞期受精卵卵裂的影响
目的:研究蛋白激酶B(PKB)的活性变化对小鼠受精卵早期发育的影响.方法:将野生型、持续激活型和激酶失活型PKB克隆至pBluescript Ⅱ/SK表达载体中,体外转录成mRNA,显微注射到1-细胞期受精卵中,观察受精卵分裂情况.结果:1-细胞期受精卵注射野生型或持续激活型PKB的mRNA后,卵裂率均增加,而持续激活型PKB的促进作用更为显著;相反注射激酶失活型PKB的mRNA后,卵裂率明显降低.结论:PKB能促进小鼠1-细胞期受精卵的发育,其活化对于小鼠受精卵的发育是必需的.
关键词： 小鼠受精卵 蛋白激酶B(PKB) 定点突变
