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乳头瘤病毒病毒样颗粒的研究进展
乳头瘤病毒病毒样颗粒(VLP)主要衣壳蛋白L1体外表达后自我组装成结构和功能类似天然病毒的颗粒,在HPV诊断、防治等方面有重要作用.本文就HPV VLP的制备、结构,病毒组装机理,病毒与细胞相互作用以及VLP在血清学检测中的应用等方面作一综述.
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小鼠白细胞介素5真核表达质粒pVAX1-mIL-5的构建及其体外表达
目的构建能表达小鼠白细胞介素5(mIL-5)的质粒并鉴定其蛋白的体外瞬时表达. 方法以含有mIL-5cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得小鼠IL-5基因片段后,定向插入真核表达载体pVAX1中,获得重组表达质粒pVAX1-mIL-5.通过双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定.采用间接免疫荧光技术检测pVAX1-mIL-5在HeLa细胞的瞬时表达.结果酶切、PCR及测序鉴定证实,插入片段正确,间接免疫荧光检测表明其可以在HeLa细胞中瞬时表达. 结论构建的真核表达质粒pVAX1-mIL-5可以在HeLa细胞中瞬时表达小鼠IL-5的蛋白,为下一步利用IL-5作为DNA疫苗黏膜免疫佐剂研究奠定了基础.
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口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装
PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1(+);另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGETTM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D.将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳.结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白.其中重组质粒pTARGET/P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳.
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霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达
目的 构建霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达.方法 用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxA上切下ctxA基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子pcDNA3.1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxA转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定.结果重组质粒pcDNA3.1-ctxA成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达,用Western blot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29 ku的蛋白.结论 成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxA,并在NIH3T3细胞中表达出29 ku的CTA蛋白.
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B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达
本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒栽体,观察其在293T细胞中的表达情况.用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ANRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照.在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFVE基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合.结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%.RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA.感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ:C)分别为12%、43%、87%.PCR法扩增出了534bp的特异性片段.结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FWⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A.
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中国甲型肝炎病毒龙甲株全基因序列的cDNA克隆及序列分析
甲型肝炎是我国主要传染病之一,经粪-口途径传播.甲型肝炎病毒(HAV)在组织培养中生长缓慢,滴度低,限制了甲型肝炎疫苗及诊断试剂的生产.因此有必要克隆我国自己的HAV基因,为体外表达HAV抗原打下基础.HAV属小RNA病毒科肝病毒属,为无包膜的单链RNA病毒,含有长约7.5 kb的正链RNA,5′端有长的非编码区,3′端有polyA的尾巴.基因组含有一个长的开放读码框架,编码2 227个氨基酸的大蛋白.基因排列顺序为:5′-NCR-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′NCR,其中VP4至VP1为结构蛋白区又称P1区,2A至3D为非结构蛋白区,又称P2(2A-2C),P3(3A-3D)区.HAV只有一个血清型,结构蛋白抗原具有构型依赖性,抗原序列相对保守.其中5′NCR、2B、2C、3A及3′NCR区对细胞培养株的适应性有关,3C为蛋白酶区,几乎切割多蛋白的所有位点,3D为RNA聚合酶区[1].我们对我国HAV龙甲株全序列的cDNA克隆及序列进行了分析,并与HM175株[2]和MBB株[3]以及已发表的甲肝病毒龙甲株结构区基因[4]进行了比较.
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脐血单个核细胞表达IL-12、IFN-γ及其mRNA的观察
白细胞介素12(IL-12)的主要作用是促进TH1细胞和自然杀伤细胞(NK)产生γ-干扰素(IFN-γ),介导细胞免疫.脐血单个核细胞(CBMC)产生 IL-12的能力鲜见报道.重组 IL-12(rIL-12)在体外能促进新生儿CD4+T细胞产生IFN-γ [1].本文用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测8例CBMC体外表达IL-12p40 mRNA和IFN-γ mRNA的能力;用ELISA法测定8例CBMC培养上清液IFN-γ水平,并观察 rIL-12对CBMC IFN-γ及其mRNA表达的影响.
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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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HCV干扰素敏感决定区"基因盒"的构建,体外表达及功能探讨
目的:构建对干扰素敏感和不敏感的丙型肝炎患者的干扰素敏感决定区(ISDR)基因;在体外表达含ISDR的丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白,探讨表达的NS5A蛋白是否通过ISDR与干扰素诱导的RNA蛋白激酶(PKR)结合来影响干扰素的抗HCV作用.方法:采用合成寡核苷酸,PCR,分子克隆等方法构建ISDR基因"盒",包括3个对干扰素敏感的丙肝患者ISDR及1个对干扰素耐受的丙肝患者ISDR,将含不同ISDR的NS5A基因克隆进原核表达载体PRSET,转染BL21(DE3)细胞后由IPTG诱导表达,获得蛋白过柱纯化及透析去掉高盐后,与经体外转录和翻译系统获得的PKR进行蛋白结合试验.结果:经测序证实获得4个不同ISDR基因,包括1个对干扰素不敏感基因和3个对干扰素敏感基因;体外表达的含ISDR的NS5A蛋白约58 000,体外试验初步证实,无论对干扰素敏感或不敏感的ISDR均可与PKR结合.结论:体外构建的含不同ISDR的NS5A蛋白能在原核细胞系统中获得较好表达;研究显示,ISDR影响干扰素抗病毒作用可能不是由ISDR与PKR直接结合导致的.
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高苯丙氨酸对神经元Rho GTPases基因体外表达的研究
采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法,观察高苯丙氨酸对神经元Rho GTPases主要家族成员Rac1、Cdc42、RhoA mRNA体外表达的影响,并进一步研究脑源性神经营养因子(BDNF)对它们的作用,探寻高苯丙氨酸导致神经损伤的可能机制及BDNF在体外对神经损伤的保护机制.
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NMDA受体亚基NR1的体外表达及功能检测
目的:体外表达NMDA受体亚基NR1 并了解其电生理学特性,探讨体外表达受体亚基的意义.方法:将克隆的NMDA受体亚基NR1 质粒DNA经体外转录成RNA,显微注射到爪蟾卵母细胞后进行受体表达,采用双电极电压钳位技术记录表达的NR1 亚基的激活电流.结果:注射NR1 亚基RNA的爪蟾卵母细胞能表达出具有电生理学功能的受体,其激活电流能被D-AP5 阻断等特性,说明该表达的NR1 亚基具有NMDA受体的功能.结论:爪蟾卵母细胞表达的NR1 亚基具有NMDA受体的生物学功能,爪蟾卵母细胞可以用于体外受体表达.
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血管内皮生长因子基因转染胶质瘤细胞在治疗缺血性脑血管病中的意义
在所有可以诱导新生血管形成的基因中,血管内皮生长因子(VEGF)是目前有前景的一个基因,在治疗心肌缺血和肢体缺血方面,VEGF基因治疗已得到成功应用[1,2].鉴于VEGF是一种高效的特异性的可以诱导新生血管形成的内皮细胞有丝分裂原[3],我们希望将VEGF基因引入缺血性脑血管病的治疗领域.脑胶质细胞具有潜在的VEGF分泌功能,在脑缺血的情况下,胶质细胞可以分泌少量的VEGF,但VEGF的表达量不足难以诱导可以改善缺血区血液供应的新生血管形成.为此,我们选择胶质细胞作为VEGF基因治疗缺血性脑血管病基因转染的靶细胞,并研究VEGF基因的体外表达.
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白细胞介素10基因克隆及其真核表达载体的构建与鉴定
目的 克隆人白细胞介素10(hIL-10)基因,以构建真核表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达情况.方法 从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增hIL-10基因,分别构建含hIL-10目的 基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,经酶切、PCR和DNA测序鉴定;重组表达载体pVAX1-hIL10转染COS-7细胞,观测hIL-10的瞬时表达情况.结果 构建了重组克隆载体pMD18T-hIL10和真核表达载体pVAX1-hIL10,经酶切、PCR及测序鉴定正确,插入片段序列与GenBank已公布的hIL-10基因序列一致;pVAX1-hIL10可以有效地转染COS-7细胞,Western blot结果 表明hIL-10在COS-7细胞中瞬时表达.结论 成功克隆了hIL-10基因,构建的表达载体pVAX1-hIL10在COS-7细胞中瞬时表达hIL-10蛋白,为进一步研究其生物学功能和临床应用奠定了基础.
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人凝血因子Ⅷ体外高效表达体系的建立
目的 构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,观察其在体外培养细胞中的表达情况.方法 用限制性内切酶酶切法获得B区缺失的人FⅧ基因(BDDhFⅧ cDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208的多克隆位点,构建慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,限制性内切酶酶切法鉴定载体的连接方向.采用三质粒共转染293T细胞制备病毒颗粒,包装后感染人肺、肾HLF细胞、张氏肝(Chang-Liver)细胞和成人骨髓基质细胞(MSC),并以pXZ171作为对照.流式细胞术(FCM)检测载体的感染效率,一期法检测细胞培养上清中FⅧ的活性,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合.结果 成功构建了慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,包装后能有效感染多种靶细胞,感染效率分别为:HLF细胞(74.52±7.57)%、MSC(42.34±5.84)%和Chang-Live细胞(27.24±6.53)%.感染后48 h检测到HLF细胞、Chang-Liver细胞和MSC培养上清中有FⅧ的表达,FⅧ活性分别为(54.1±5.6)%、(22.5±2.9)%和(12.5±2.7)%.PCR检测到目的 基因的整合.结论 成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染多种靶细胞并表达有活性的FⅧ.
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同源型凝血活酶试剂检测重组人野生型和突变型凝血因子Ⅶ
遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺乏症患者血浆中FⅦ凝血活性降低,出现不同程度的出血倾向.早先我们报道了遗传性FⅦ缺乏症2个家系患者的FⅦ基因存在Cys329Gly错义突变[1,2].为了研究该突变对FⅦ的功能影响,我们将野生型FⅦ和Cys329Gly突变型真核表达载体转染BHK-21细胞进行体外表达,并用自制同源型凝血酶原试剂[3]对表达产物进行凝血活性的检测.
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抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选
目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NH-LBP抗体.方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NH-LBP高度结合的单链抗体片段.结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340 bp和325 bp,经连接后约为750 bp.经过体外表达得到了约27 000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NH-LBP高度结合的抗体.结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NH-LBP高度结合的抗体.
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P-糖蛋白基因疫苗的构建与鉴定
目的制备P-糖蛋白基因疫苗.方法利用PCR方法扩增编码人类P-糖蛋白多药耐药基因序列胞外区约1kb片段,与真核表达载体pcDNA3进行定向重组,限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切反应及测序鉴定该重组基因疫苗,磷酸钙共沉淀法转染人类K562红白血病细胞,经G418筛选后,免疫组化分析该重组基因疫苗表达产物的抗原特异性.结果构建了pcDNA3-MDR1重组基因疫苗.限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切分别显示5.4kb的载体片段及约1kb的插入序列,测序948个碱基中除2个碱基突变外均与原序列排列相符.免疫组化方法证实细胞膜表面MDR1约1kb片段的表达产物可被抗Pgp抗体识别.结论构建的pcDNA3-MDR1重组基因疫苗可被市售的Pgp抗体特异性识别,具有Pgp抗原特异性.
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人乳头瘤病毒16型预防性疫苗的研究进展
人乳头瘤病毒16型(HPV16)与宫颈癌的发生关系密切,由于该病毒尚不能在体外有效培养,而限制了预防性疫苗的研究进展.目前通过分子生物学方法在体外表达HPV16病毒样颗粒(VLPs)成为预防性疫苗研究的热点.研究表明VLPs可诱导机体产生抗病毒攻击的细胞免疫和体液免疫应答,从而为预防性基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要科学依据.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5B的研究进展
已知丙型肝炎病毒非结构蛋白(NS5B)具有RNA依赖的RNA聚合酶的功能,负责病毒基因组的复制.通过体外表达及晶体衍射分析,目前对NS5B的三维结构已有了清晰的描述,对NS5B催化该病毒基因组复制的分子机制也有了初步了解;对RNA聚合酶抑制物的研究将为人工设计特异性的抗该病毒药物奠定扎实基础.
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人精子膜抗原基因PH-20 DNA疫苗质粒的构建
精子膜抗原与受精和胚胎的早期发育有密切关系,其中部分抗原能引起机体产生相应的抗体,导致免疫性不育[1].PH-20(posterior head 20)在精子表面的特异性分布及其在受精过程中的作用,使其作为免疫避孕候选疫苗一直受到人们的关注[2].核酸疫苗在体内为真核天然表达,不需要体外表达、纯化,且具有免疫持续时间长,制备、携带方便,廉价等优点[3].PH-20是一种多功能蛋白[4],存在两个变体.本实验选择PH-20变体2,应用RT-PCR克隆出PH-20 2 cDNA,再以真核表达质粒pcDNA3.1为载体构建PH-20 DNA疫苗,为进一步研究免疫避孕疫苗奠定了实验基础.