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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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疫苗预防天花
背景:天花已于1980年消灭,但是,它可能用作生物武器,重又引起人们研制保护性疫苗的兴趣.因此,人们研究了贮存的牛痘苗和新近研制的细胞培养疫苗为天花应急计划提供资料,同时研制了新型(非复制型)疫苗.
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复制型腺病毒的研究进展
腺病毒作为肿瘤治疗手段的应用早可以追溯到上个世纪的50年代,但当时利用野生型腺病毒对30个临床病人的治疗并未获得可靠的治疗效果,因此很快研究被终止.随后的研究发展出复制缺陷型腺病毒载体,用来介导抗肿瘤基因进行肿瘤治疗,这种腺病毒载体具有很多的优越性[1]:1.
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可复制型抗乙肝免疫基因治疗剂pSVK-HBVE的构建与表达
目的 构建能同时表达抗体小分子靶向干扰素(dsFvα)和人白介素12(hIL-12)的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE.方法 将pVAX-HBVE质粒双酶切,回收dsFvα-IRES-hIL12片段;将dsFvα-IRES-hIL12片段克隆入早期构建的pSVK载体,得到重组质粒pSVK-HBVE.将重组质粒瞬时转染到293T细胞,ELISA法检测目的基因表达;提取重组质粒pSVK-HBVE,注射乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转基因小鼠体内HBV基因拷贝数的变化.结果 pSVK-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pSVK-HBVE 30 μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级.结论 成功构建能够同时表达抗体靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒,为慢性乙肝免疫基因治疗提供新的备选方案.