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HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建
目的 构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体.方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体.结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确.结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础.
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人白介素-12蛋白在人源骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及抗肿瘤活性研究
为研究人骨肉瘤细胞(U2-OS)表达人白介素12(hIL-12)的可行性,利用Lipofectamine 2 000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR法及Western-blot法检测人白介素(hIL-12)在细胞的表达,并对产物活性进行了验证.将hIL-12成熟肽基因序列5'端添加Hind Ⅲ酶切位点,3'端添加6×His标签及Bam HI酶切位点,再将基因通过5'Hind Ⅲ和3'Bam HI克隆至载体pcDNA3.1上,后转化大肠杆菌DH5α,挑取转化子并提取质粒进行酶切及测序验证.获得重组表达质粒pcDNA3.1-hIL-12,利用Lipofectamine 2000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR法及Western-blot法检测hIL-12的表达.High affinity Ni-charged resin纯化hIL-12,动物体内验证其抗肿瘤活性.实验研究显示,通过基因转染技术可以将hIL-12基因导入到人U2-OS细胞,组成hIL-12的人源表达系统,经验证,hIL-12基因在U2-OS细胞内表达相应蛋白.活性研究显示,荷瘤小鼠体内IFNγ水平显著升高,脾脏细胞毒T细胞(CTL)活性及自然杀伤性细胞(CK)活性均显著升高,肿瘤重量也明显降低.
关键词： 人源癌U2-OS细胞 hIL-12 转染 肿瘤 -
结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定
目的 构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定.方法 通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中.分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变.结果 重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高.结论 成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础.
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结核杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建与表达
目的克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因,导入真核表达载体pCI-neo,并在真核细胞中进行表达.方法采用基因工程技术,首先以pcDNA3.1(+)-Mtb8.4为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增出Mtb8.4-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-Mtb8.4-linker(pML)重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12 基因,将hIL-12 基因与pML质粒进行连接重组,构建成Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定;重组嵌合质粒转染COS-7细胞后,用RT-PCR方法鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况.结果 Mtb8.4/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功;转染COS-7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平成功表达.结论 Mtb8.4/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS-7细胞中的成功表达,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础.
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结核分枝杆菌mtb8.4/hIL12嵌合基因的克隆及真核表达质粒的构建
目的:克隆结核分枝杆菌mtb8.4/hIL12嵌合基因,构建其真核表达质粒,并进行鉴定.方法:采用基因工程技术,首先以pcDNA 3.1(+)-mtb 8.4为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增出mtb 8.4-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-mtb 8.4-linker(pML)重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12基因,将hIL-12基因与pML质粒进行连接重组,构建成mtb 8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定.结果:mtb 8.4/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功.结论:mtb 8.4/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病mtb 8.4/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础.
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人IL-12基因表达对含信号肽mtb8.4基因疫苗的免疫效应
[目的]观察结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)表达质粒联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答.[方法]15只C57BL/6N小鼠随机分为MS基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平;采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性.[结果]联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平(分别为(1546.18±36.23)pg/ml、(681.64±40.88)pg/ml),显著高于MS基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强.[结论]hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后,能够增强MS基因疫苗所诱导的细胞免疫应答.
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含信号肽的Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达
[目的]克隆结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4(MS)/hiL12嵌合基因,导入真核表达载体pCI-neo,并在COS-7细胞中进行表达.[方法]首先以pcDNA3.1(十)-含信号肽的Mtb8.4(pMS)为模板,经聚分酶链反应(PCR)扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-MS-linker(pMSL)重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12基因,将hIL-12基因与pMSL质粒进行连接重组,构建成MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定:重组嵌台质粒转染COS-7细胞后,用RT-PCR方法鉴定MS/hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况.[结果]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功;转染COS-7细胞后,MS/hIL12嵌合基因在转录水平成功表达.[结论]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS-7细胞中的成功表达,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础.
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可复制型抗乙肝免疫基因治疗剂pSVK-HBVE的构建与表达
目的 构建能同时表达抗体小分子靶向干扰素(dsFvα)和人白介素12(hIL-12)的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE.方法 将pVAX-HBVE质粒双酶切,回收dsFvα-IRES-hIL12片段;将dsFvα-IRES-hIL12片段克隆入早期构建的pSVK载体,得到重组质粒pSVK-HBVE.将重组质粒瞬时转染到293T细胞,ELISA法检测目的基因表达;提取重组质粒pSVK-HBVE,注射乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转基因小鼠体内HBV基因拷贝数的变化.结果 pSVK-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pSVK-HBVE 30 μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级.结论 成功构建能够同时表达抗体靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒,为慢性乙肝免疫基因治疗提供新的备选方案.
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HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用
目的 构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE.方法 将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE.将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAX-HBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化.结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30 μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级.结论 成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略.
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人IL-12表达质粒联合含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果
目的:研究结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠后, 诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.方法:将40只C57BL/6N小鼠随机分为联合免疫组(MS基因疫苗+hIL-12组)、 MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组.将基因疫苗、空载体和PBS, 经肌内注射免疫各组小鼠, 每隔3周免疫1次, 共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106 CFU BCG免疫1次.采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞的杀伤活性.用结核杆菌强毒株H37Rv静脉攻击小鼠后, 计数肺和脾组织中结核杆菌的菌落数.对小鼠的部分肺和脾组织作病理切片, 经HE染色观察组织病变的程度, 经ZN染色检查抗酸杆菌, 观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.结果:联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答, 免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的水平, 与BCG组相当, 显著高于MS基因疫苗组, IL- 4分泌减少, 特异性CTL的杀伤活性增强, 对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果.表现为小鼠肺和脾组织中结核杆菌的菌落数显著减少, 组织病变明显减轻, 其效果与卡介苗(BCG)组相当, 但优于MS基因疫苗组.结论:以hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后, 能显著增强MS基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.
关键词： 含信号肽Mtb8.4(MS) hIL-12 联合免疫 细胞免疫应答 小鼠 -
Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫原性
目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS-7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性.方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCI-neo中,构建pCI-neo-Mtb8.4/hIL12重组真核质粒.用限制性内切酶消化、 PCR及DNA序列测定等鉴定后,转染COS-7细胞,用RT-PCR和Western blot鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达.用Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫C57BL/6N小鼠,收集脾细胞培养上清检测细胞因子的水平,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用.结果:pCI-neo-Mtb8.4/hIL12重组质粒构建成功.以其转染COS-7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平获得表达.Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,IFN-γ和IL-2的分泌增加,IL- 4的分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强.结论:成功地构建pCI-neo-Mtb8.4/hIL12重组质粒,并在COS-7细胞中表达.构建的Mtb8.4/hIL12基因疫苗具有较强的免疫原性,可明显诱导CTL的杀伤活性.
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结合RNAi技术的三重表达HCV DNA疫苗的构建及其在HepG2细胞中的表达
目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达.方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH Ⅰ位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达.结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功.在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清.结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应.为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础.
