Egr1启动子介导的HSV-TK/GCV联合放疗对卵巢癌细胞的治疗作用

目的 探讨Egr1启动子介导的HSV-TK/GCV自杀基因系统与放疗联合治疗卵巢癌的疗效.方法 以MTT方法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪分析细胞凋亡和坏死情况,倒置光学显微镜和电子显微镜观察治疗前后细胞形态学变化,并与单纯的辐射治疗比较.结果 辐射-基因治疗对卵巢癌HO8910细胞有生长抑制和凋亡诱导作用,效果明显优于单纯的放疗,干预60 h、72 h、96 h后,辐射-基因治疗组的细胞增殖抑制率分别达到(56.88±5.35)％、(69.09±3.43)％、(86.91±0.75)％,而单纯辐射组对应的细胞增殖抑制率仅为(21.93±11.37)％、(37.99±7.24)％、(69.55±3.26)％.干预48 h后,辐射-基因治疗组的细胞死亡率为26.01％(凋亡率:19.45％;坏死率:6.56％),明显高于单纯辐射组的12.47％(凋亡率:8.68％;坏死率:3.79％)和阴性对照组的4.41％(凋亡率:2.52％;坏死率:1.89％).细胞形态学观察结果也显示辐射-基因治疗组细胞呈现了典型的凋亡形态学特征,细胞生长状态远不如单纯辐射组和阴性对照组.结论 辐射-基因联合应用具有较好的协同和互补效应,比单一的放疗具有更强的抗肿瘤作用.

HSV-TK/GCV联合IL-2对人舌癌移植瘤的抑制作用

目的 观察HSV-TK联合IL-2对人舌癌细胞生长的抑制作用,并初步探讨其作用机理.方法 建立舌癌Tca8113移植瘤动物模型,采用HSV-TK基因联合IL-2基因对人舌癌移植瘤进行裸鼠体内实验.实验分A、B、C、D四个实验组,每组5只裸鼠.A组为对照组,每瘤注射生理盐水;B组为空病毒组,每瘤注射空病毒5×108PFU;C组为单纯TK治疗组,每瘤注射TK 5×108PFU;D组为TK联合IL-2治疗组,每瘤注射TK(5×108PFU)+IL-2(5×108PFU).48小时以后,对B、C、D组裸鼠每日腹腔注射GCV,100mg/kg/日,2次/日,连续10天.后一次给药后第二天处死裸鼠,测量肿瘤重量并计算抑瘤率;光镜观察移植瘤组织学变化,透射电镜观察细胞的超微结构.结果 A、B、C、D组裸鼠瘤重量均数分别为:1.52±0.49g,1.44±0.42g,0.91±0.24g,0.36±0.24g.C组的抑瘤率为40%;D组抑瘤率为76%.经统计学检验发现TK组和TK联合IL-2组的肿瘤生长均受到抑制,A组和C组、A组和D组之间有显著性差异(P＜0.01).与单用TK组比较,TK联合IL-2组抗瘤作用明显增强.光镜观察发现,TK组肿瘤组织呈灶状凋亡,可见核固缩的细胞.TK联合IL-2组凋亡细胞增加,肿瘤细胞减少.电镜观察发现,TK组和TK联合IL-2组出现大量的细胞凋亡:凋亡细胞皱缩,胞核体积缩小,染色质浓缩,电子密度增加,呈新月状边集于核膜下.结论 TK联合IL-2治疗可显著抑制Tca8113移植瘤的生长,其治疗效果优于TK单独应用.

HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建

目的 构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体.方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体.结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确.结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础.

腺病毒介导的KDR－HSV－tk系统对血管内皮细胞的杀伤作用及旁观者效应

目的：研究腺病毒介导的KDR－HSV－tk系统对血管内皮细胞的杀伤作用及旁杀效应。方法体外构建受 KDR启动子和巨细胞病毒（ CMV）启动子调控并可表达HSV－tk基因的AdKDR－HSV－tk和AdCMV－HSV－tk，经293细胞包装、扩增后，分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和不表达KDR的人鼻咽癌细胞CNE－2，建立HUVEC／tk及CNE－2／tk，观察丙氧鸟苷（GCV）处理后 HUVEC 杀伤率及旁观者效应。结果受感染的HUVEC和CNE－2细胞中均有绿色荧光蛋白的表达。在感染复数（ MOI）为100的条件下，GCV浓度由0增至50 mg／L 时含 AdKDR－HSV－tk的HUVEC和CNE－2细胞存活率从100％分别降至（23．1±3．9）％和（69．8±3．1）％（P＜0．01）；感染AdCMV－HSV－tk的HUVEC和 CNE－2细胞存活率从100％分别降至（13．9±2．9）％和（15．7±5．2）％（P＜0．05）；HUVEC／tk细胞对GCV的敏感性明显高于亲代HUVEC细胞， HUVEC＋HUVEC／tk混合细胞的生存率随HUVEC／tk比例的增加而下降，说明AdKDR－HSV－tk／GCV系统不但能杀伤转染tk基因的HUVEC，也能杀伤未导入转染tk基因的HUVEC细胞，存在明显的旁观者效应。结论腺病毒介导的KDR－HSV－tk／GCV系统对血管内皮细胞具有特异的杀伤作用及旁观者效应，为抗肿瘤血管靶向治疗奠定了基础。

含HSV-tk基因重组体腺病毒的构建

单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷酸酶(HSV-tk)基因是一种自杀基因,其产物可将无毒的核苷类似物如Gancilovir(GCV)转变成有毒的产物,从而将细胞杀死[1].近年来,许多学者利用多种载体将HSV tk基因转入肿瘤细胞.腺病毒是继逆转录病毒之后一种非常有前途的基因载体,具有表达效率高,滴度高,易纯化和制备,感染宿主细胞范围广,对人类较安全等优点[2].为了探索HSV-tk基因对肺癌的治疗作用,我们构建了含HSV-tk基因重组体腺病毒.

VP22的细胞间传递作用对HSV-tk/GCV的肿瘤细胞杀伤促进效应

目的： 探讨VP22的细胞间传递作用对HSV-tk/GCV杀伤肿瘤细胞的促进作用。方法： 将VP22与报告基因-绿色荧光蛋白基因（GFP）或前药酶基因-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）构建在同一载体上，进行DNA序列分析鉴定；将此融合基因载体转染293T或COS7细胞，免疫荧光分析确定转染情况和细胞间传递作用；在前药GCV不同浓度、转染与未转染细胞比例不同时，MTT法检测细胞增殖情况；利用转染细胞培养液上清培养未转染细胞，确定旁观者效应是否由培养液转移。结果： PCR及序列分析显示融合基因插入载体正确；对293T或COS7细胞转染率可达25％～30%，且证明融合蛋白已被表达并在细胞间传递；HSV-tk与VP22融合后在前药GCV浓度低至0.1μg/ml时就可显示出细胞杀伤效应增强，并随着表达VP22-HSV-tk细胞比例的增加，细胞杀伤作用增强。结论： VP22介导的自杀基因产物的细胞间传递作用可解决自杀基因的低效细胞毒作用，明显增强细胞杀伤效应。

HSV-TK/GCV系统的临床应用及分析

自杀基因疗法又称药物敏感基因疗法、分子化疗或病毒介导的酶解前药疗法(virus directed enzyme/prodrug therapy,VDEPT).该疗法通过将基因导入细胞表达某种酶,该酶能将无毒或弱毒的前药转化为对细胞有毒性的药物,从而引起细胞死亡,该基因被称为"自杀基因".

HSV-tk基因联合其他疗法治疗肿瘤进展

1基因导向性酶前体药物概述基因导向性酶前体药物疗法(gene directed enzyme prodrug therapy,GDEPT),亦称自杀基因疗法(suicide gene therapy),为目前肿瘤生物治疗引人注目的研究领域,是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后,一种具有良好应用前景的肿瘤治疗新措施.自杀基因的表达产物能将无毒性的前体药物代谢成为毒性产物,干扰核酸代谢影响肿瘤细胞DNA合成,从而导致肿瘤细胞死亡.目前研究深入且与肿瘤治疗关系密切的自杀基因是TK及CD基因.单纯疱疹病毒-腺苷激酶(herpeslsimples virus-thrmidine kinase,HSV-tk)/丙氧鸟苷(gancyclovir,GCV)是目前应用多的自杀基因治疗系统.

Objective To investigate the effects of combination adenovirus-mediated HSV-tk/GCV system and antisense IGF-1 gene therapy for rat glioma and analyze the mechanism.Methods Using the recombinant adenovirus vector,GCV killing effeciency after combined gene transfer of HSV-tk and antisense IGF-1 was observed in vitro.Rat glioma was treated with HSV-tk/GCV and antisense IGF-1 and the survival rate of rats was observed.Results C6 cells transfected with tk and antisense IGF-1 gene were more sensitive to GCV than that transfected with tk gene alone.The survival of the combination gene therapy group was prolonged significantly and large amounts of CD+4,CD+8 lymphocytes were detected in the tumor tissues.Conclusion Antisense IGF-1 gene may enhance the tumor-killing effects of HSV-tk/GCV.

腺病毒介导CD-TK融合基因对肾癌细胞的杀伤作用

肾癌是常见的泌尿系肿瘤,发病率仅次于膀胱肿瘤.自杀基因治疗在晚期肿瘤的综合治疗中发挥了重要作用.单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因/无环鸟昔(GCV)及大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因/5-氟胞嘧啶(5-FC)系统治疗机制不同,联合可产生协同效应.本研究旨在探讨联合TK/GCV、ClD/5-FC系统在肾癌治疗中的价值.

HSV-tk/GCV系统联合重组人TNF-α治疗脑胶质瘤的离体实验研究

目的 探讨HSV-tk/GCV系统联合rhTNF-α抗脑胶质瘤的有效性.方法 利用重组HSV-tk逆转录病毒载体转染大鼠C6细胞得到HSV-tk阳性细胞,C6/GCV、C6+tk/GCV、C6+rhTNF-α和C6+tk/GCV+rhTNF-α4组在体外分别给予GCV或/和rhTNF-α处理,用MTT法测量细胞存活率,比较各组肿瘤细胞存活率.卡方检验作显著性检测.结果 未加任何抗癌因子处理的C6细胞组肿瘤细胞生长旺盛,细胞形态无明显改变;各处理组的肿瘤细胞2～3天后开始逐渐出现细胞突触消失,细胞变圆,胞体皱缩,核仁固缩、裂解、甚至消失,继而逐渐死亡.联合应用HSV-tk/GCV+rhTN-α组的肿瘤细胞存活率比单纯应用HSV-tk/GCV组或rhTNF-α组明显低(P＜0.05).结论:联合应用HSV-tk/GCV系统和rhTNF-α的杀癌细胞效果优于单一使用HSV-tk/GCV系统或者rhTNF-α.

HSV-TK基因治疗在前列腺癌中的研究进展

HSV-TK基因治疗应用于前列腺癌的研究进展迅速,成为有希望进入临床应用的基因治疗方法之一.本文对HSV-TK基因治疗的原理、效果、联合治疗乃至临床实验的研究作一综述.

脂质体介导的HSV-tk基因转移对烫伤大鼠成纤维细胞凋亡的影响

目的 通过脂质体介导外源基因转导烧伤创面的手段,探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转移对创面成纤维细胞凋亡的影响.方法 利用我们已经构建成功的重组真核表达质粒pcDNA3.1/HSV-tk,通过脂质体介导转染烫伤大鼠皮肤组织,用RT-PCR法检测HSV-tk基因的表达,在给与抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)后,用透射电镜观察成纤维细胞的凋亡情况.结果 RT-PCR结果 显示脂质体介导的tk基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达,给予GCV后可诱导表达tk基因的成纤维细胞出现凋亡.结论 脂质体介导的HSV-tk基因转移可促进成纤维细胞凋亡.

单端羧基聚乙二醇/鱼精蛋白系统介导HSV-TK基因在宫颈癌细胞中的体外研究

目的 研究非病毒载体MPEG-C-鱼精蛋白系统的制备方法、其对不同剂量鱼精蛋白与单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的结合能力以及对HeLa细胞的影响.方法 将一定量的MPEG-C-和不同量的鱼精蛋白混合后与DNA室温孵育,得到MPEG-C-鱼精蛋白/DNA复合物;用琼脂糖电泳实验测定不同N/P比形成复合物时对HSV-TK的阻滞情况; 用结合沉淀试验比较不同量鱼精蛋白对包裹HSV-TK的能力的影响;MTT 法检测MPEG-C-鱼精蛋白对HeLa 宫颈癌细胞的毒性作用及其复合物对HeLa细胞的转染率.结果 MPEG-C-鱼精蛋白复合物包裹HSV-TK的能力随N/P比增大而增强;粒径随N/P比增大而减小,可达200 nm左右;复合物的Zeta 电位随N/P比增大而增强;与单独鱼精蛋白复合物相比,细胞转染率有所降低.结论 MPEG-C-鱼精蛋白是一种制备工艺简单、对HSV-TK包裹能力高、细胞毒性小、具有一定价值的非病毒载体.

不同拷贝数CArG/5HRE+HSV-TK系统辅助伽玛刀杀伤C6胶质瘤的初步研究

目的 研究不同拷贝数CArG/5HRE+ HSV-TK系统辅助伽玛刀杀伤C6胶质瘤效果,寻求伽玛刀条件下对胶质瘤杀伤更有效的适宜拷贝数CArG/5HRE+ HSV-TK系统.方法 在Wistar大鼠颅内C6胶质瘤模型的基础上,构建不同拷贝数CArG/5HRE+ HSV-TK质粒(空质粒转染+伽玛刀照射组、HSV-TK+伽玛刀照射组、4CAG/5HRE启动子+伽玛刀照射组、9CArG/5HRE启动子+伽玛刀照射组、12 CArG/5 HRE启动子+伽玛刀照射组),通过脂质体转染到大鼠颅内胶质瘤组织中,对瘤组织伽玛刀放射外科治疗后取大鼠肿瘤组织.通过对瘤组织常规病理、瘤体细胞凋亡、HSV-TKmRNA及蛋白表达的观察,确定不同拷贝数CArG/5HRE+ HSV-TK系统辅助伽玛刀诱导HSV-TK表达及对C6胶质瘤杀伤效果.结果 各组肿瘤细胞均可见凋亡、破坏,CArG/HRE双启动子+伽马刀照射组更为明显(P＜0.05),尤以9CArG/5HRE启动子+伽马刀照射组为突出,凋亡率为(0.71±0.12)％ (P＜0.05);CArG/HRE双启动子+伽马刀照射组中HSV-TK mRNA及蛋白表达较无启动子组明显增加(P＜0.05),9CArG/5HRE启动子+伽马刀照射组为明显,HSV-TK mRNA的相对表达量为(0.84±0.09,P＜0.05).结论 在SRS治疗条件下,CArG/HRE双启动子能促进目的基因HSV-TK的表达,增加对C6胶质瘤细胞的杀伤,其中,9CArG/5HRE双启动子的作用明显.

全反式维甲酸增强HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的观察

目的体外观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对BIU-87细胞缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)及旁观者效应的影响.方法用染料划痕标记技术观察ATRA对BIU-87细胞GJIC功能的影响,MTT法观察ATRA处理后HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的变化.结果ATRA显著改善BIU-87细胞GJIC功能,并提高HSV-TK/GCV的旁观者杀伤作用.结论ATRA可以改善BIU-87细胞间通讯功能,可能是ATRA增强HSV-TK/GCV旁观者效应的重要原因之一.

逆转录病毒介导HSV-TK基因治疗膀胱癌及旁观者效应的观察

目的观察HSV-TK/GCV治疗膀胱癌的体内效果及旁观者效应.方法用逆转录病毒感染鼠源性膀胱癌细胞T739,以不同比例的T739和T739TK细胞建立膀胱癌腹腔肿瘤模型,同时,在背部皮下以母代细胞T739建立皮下肿瘤,观察GCV治疗前后肿瘤大小变化及动物存活时间.结果动物存活时间随基因转移效率提高而延长,腹腔肿瘤生长受到抑制,背部肿瘤在50%以上转移效率时肿瘤生长缓慢.结论 HSV-TK/GCV对膀胱癌的体内杀伤效应随基因转移效率提高,并存在远距离旁观者效应.

人卵巢癌基因治疗的几种方案

卵巢癌的基因治疗业已取得了很大的进展.重组回旋病毒、腺病毒或非病毒脂质体有可能作为安全、有效的媒介物质;分子化学疗法、突变补偿、免疫增强和耐药性变化等基因治疗方法不断得到了发展和完善.部分治疗方案(特别是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷激酶方案等)已进入了临床试用阶段.

丹参酮ⅡA对HSV-TK/GCV系统治疗肺癌细胞株的影响

目的观察并探讨丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK/GCV)系统对治疗人小细胞肺癌细胞株的影响.方法用逆转录病毒感染H446细胞,筛选出含TK基因的H446细胞(H446/TK).用丙氧鸟苷(GCV)及Tan ⅡA处理不同比例混合的H446、H446/TK细胞,用MTT比色法检测细胞存活率.结果重组逆转录病毒滴度为3.2×105 cfu/ml,电镜观察证实HSV-TK基因已导入H446细胞.H446/TK细胞对GCV的敏感性明显高于H446细胞,并存在旁观者效应;Tan ⅡA与GCV共同作用下的肿瘤细胞对GCV的敏感性大大增强,在不同比例混合的H446、H446/TK细胞中,加入Tan ⅡA组和不加丹参酮组相比较,其存活率有显著性差异(P<0.05).结论 Tan ⅡA能显著增强HSV-TK/GCV系统的旁观者效应.

HSV-TK/GCV联合IL-2治疗舌癌移植瘤的机制探讨

目的:观察HSV-TK联合IL-2对舌癌细胞的生长抑制作用,并探讨HSV-TK与IL-2联合应用对舌癌抑制和杀伤的机制.方法:建立舌癌Tca8113移植瘤动物模型,采用HSV-TK联合IL-2对移植瘤进行体内转染,观察肿瘤生长情况.使用RT-PCR检测HSV-TK基因和IL-2基因的表达情况;应用流式细胞仪检测移植瘤的凋亡情况;采用免疫组化法检测移植瘤中CD4和CD8蛋白的表达情况.结果:移植瘤体积生长曲线表明TK组(C组)及TK联合IL-2 组(D组)肿瘤的生长明显受到抑制.TK组抑瘤率为40.1%,TK联合IL-2组抑瘤率为80.2%.RT-PCR检测目的基因HSV-TK基因和IL-2基因已整合入肿瘤细胞中且稳定表达.流式细胞仪检测A组(对照组)和B组(病毒组)凋亡峰不明显,而C组和D组凋亡峰明显.对照组、病毒组、TK组、TK联合IL-2组凋亡率分别为(6.77±1.31)、(7.08±1.28)、(13.22±3.28)、(28.90±6.50).除对照组、病毒组无明显差异(P＞0.05),其他任2 组之间比较均有显著性差异(P＜0.01).在TK联合IL-2组,肿瘤细胞周围有大量CD4和CD8阳性的淋巴细胞浸润.结论:HSV-TK和IL-2治疗后可显著抑制Tca8113移植瘤的生长.HSV-TK与IL-2基因联合应用,其治疗效果较单独应用HSV-TK明显提高.HSV-TK可明显杀伤Tca8113移植瘤细胞,而IL-2可以诱导机体抗肿瘤免疫反应.