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慢病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的靶向杀伤作用
目的:研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用.方法:构建的重组质粒pLenti6/V5-D-KDR-CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6/V5-D-GFP在lipofectamine 2000介导下转染293FT细胞,包装扩增后获得病毒颗粒,体外感染表达KDR的SW620细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应.结果:重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随慢病毒滴度的增高而递增.RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,SW620细胞有目的基因CDglyTK的表达.对于转基因的SW620细胞,单用GCV(100mg/L)时,其存活率为32.34%±2.42%.单用5-FC(2.0 g/L)时,存活率为30.56%±2.14%.而联合应用两者时,SW620细胞存活率为5.36%±1.55%,LS174T细胞存活率为95.48%±1.70%.SW620细胞对前药具有较高的敏感性,SW620与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P＜0.001),双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P＜0.001).当转基因细胞比率为40%时,加入前药GCV和5-FC,SW620细胞存活率为11.42%±2.66%,而LS174T细胞存活率为99.54%±2.61%,二者比较差异有显著性意义(P＜0.001),该体系旁观者效应明显.结论:慢病毒作为载体有较高的转染效率,KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞.
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KDR启动子驱动双自杀基因靶向杀伤人胃癌细胞的作用
目的:探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的双自杀基因体系对人胃癌细胞SCG7901的靶向杀伤作用.方法:应用重组腺病毒AdEasv-KDR-CDglyTK体外感染实验组SCG7901细胞株和对照组HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对SCG7901细胞杀伤效应及其旁观者效应.结果:携带双自杀基因和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SCG7901和未转染SCG7901的细胞在细胞生长方面无显著性差异(t=0.224,P=0.823).已转染腺病毒的HepG2细胞和未转染HepG2的细胞在细胞生长方面也无显著性差异(t=0.120,P=0.904).在前药应用下,已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞表现出对前药不同的敏感性,SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性(F=109.43,P=0.000).融合基因的疗效优于单一自杀基因(F=162.22,P=0.000).将感染腺病毒细胞与未感染细胞以不同比例混和培养,观察到该体系明显的旁观者效应.结论:KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并存在旁观者效应.
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双自杀基因重组腺病毒对胰腺癌细胞特异性杀伤作用
目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK融合基因系统(Ad-KDR-CDTK)对胰腺癌细胞Capan-2特异性的杀伤作用.方法 重组腺病毒体外感染表达KDR的Capaw2细胞株,用不表达KDR的肝癌细胞HepG2做对照.观察其感染效率并以RT-PCR方法 检测转基因细胞CDTK的表达,然后给予不同浓度的前药更昔洛韦(ganciclovir,GCV)和5-氟胞嘧啶(5-fluorocy-tosine,5-FC),MTT法观察该体系对Capan-2和HepG2细胞生长增殖的影响及其旁观者效应;电镜观察细胞的病变;流式细胞仪检测细胞周期的变化和DNA含量的变化.建立Capan-2裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-KDR-CD/TK,腹腔注射前药GCV(50 mg·kg-1·d-1)和5-FC(500 mg·kg-1·d-1)14 d,观察肿瘤生长抑制效应.结果 腺病毒对两种细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR方法 检测发现转染Ad-KDR-CDTK的Capan-2细胞有目的 基因表达.MTT法检测显示前药呈剂量依赖性抑制Capan-2生长,而不表达KDR的肝癌细胞HepG2对前药不敏感,且观察到该体系对Capan-2明显的旁观者效应.电镜下可见Capan-2有凋亡改变.用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少.在Capan-2裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长.结论 KDR启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤胰腺癌细胞Capan-2,诱导胰腺癌细胞凋亡,并可显著抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长.
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腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对肝癌细胞的靶向杀伤作用
目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统(AdKDR-CDglyTK)对肝癌细胞选择性杀伤作用.方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的BEL-7402细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应.结果 所得病毒滴度为2.5×1012 pfu/ml.两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加.RT-PCR方法检测发现:感染AdKDR-CDglyTK的BEL-7402有目的基因CDglyTK的表达,感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞无目的基因表达.表达KDR的BEL-7402细胞对前药具有较高的敏感性,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(F=750.03,P＜0.001).融合基因的疗效优于任一单自杀基因(F=275.89,P＜0.05).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应.结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的肝癌细胞.
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KDR启动子驱动双自杀基因诱导胃癌细胞凋亡的实验研究
目的 探讨KDR启动子驱动双自杀基因体系对胃癌细胞凋亡的诱导作用.方法 以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV和(或)5-FC,观察该体系对SCG7901细胞的杀伤效应.分别应用透射电镜、Hoechest33258/PI染色、流式细胞仪观察细胞超微结构、细胞凋亡率和细胞周期的变化.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体转染后,95%以上SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达.表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感(P＜0.01).两种前药联合应用优于任一前药单独应用的疗效(P＜0.01).流式细胞术检测表明该体系可抑制SCG7901细胞DNA的合成,表现为S期细胞比例增高及G2期细胞减少.同时,Hoechest33258/PI染色和电镜下可见SCG7901有凋亡改变.结论 KDR启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并且该体系可以诱导胃癌细胞凋亡.
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KDR启动子启动双自杀基因对LOVO细胞的杀伤作用
目的 探讨KDR启动子双自杀基因体系对结肠癌LOVO细胞的抑制作用.方法 分别以重组腺病毒pAdEasy-KDR-CDglyTK、pAdEasy-CDglyTK转染LOVO细胞和未经转染的转染LOVO细胞,分别给予不同浓度5-FC、CCV、5-Fc+GCV,观察对细胞的抑制作用,用MTT法观察杀伤效应.结果 含有pAdEasy-KDR-CDglyTK、pAdEasy-CDglyTK对LOVO细胞有明显的杀伤作用(P<0.01);携带pAdEasy-KDR-CDglyTK组较其他两组生存率明显降低(P<0.01);联合用药生存率明显低于单一用药(P<0.01).并且具有明显的旁观者效应.结论 双自杀基因对LOVO细胞具有明显的抑制作用,联合用药优于单独用药,携带KDR启动子的双自杀基因有更强的抑制作用及旁观者效应.
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腺病毒介导的KDR－HSV－tk系统对血管内皮细胞的杀伤作用及旁观者效应
目的：研究腺病毒介导的KDR－HSV－tk系统对血管内皮细胞的杀伤作用及旁杀效应。方法体外构建受 KDR启动子和巨细胞病毒（ CMV）启动子调控并可表达HSV－tk基因的AdKDR－HSV－tk和AdCMV－HSV－tk，经293细胞包装、扩增后，分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和不表达KDR的人鼻咽癌细胞CNE－2，建立HUVEC／tk及CNE－2／tk，观察丙氧鸟苷（GCV）处理后 HUVEC 杀伤率及旁观者效应。结果受感染的HUVEC和CNE－2细胞中均有绿色荧光蛋白的表达。在感染复数（ MOI）为100的条件下，GCV浓度由0增至50 mg／L 时含 AdKDR－HSV－tk的HUVEC和CNE－2细胞存活率从100％分别降至（23．1±3．9）％和（69．8±3．1）％（P＜0．01）；感染AdCMV－HSV－tk的HUVEC和 CNE－2细胞存活率从100％分别降至（13．9±2．9）％和（15．7±5．2）％（P＜0．05）；HUVEC／tk细胞对GCV的敏感性明显高于亲代HUVEC细胞， HUVEC＋HUVEC／tk混合细胞的生存率随HUVEC／tk比例的增加而下降，说明AdKDR－HSV－tk／GCV系统不但能杀伤转染tk基因的HUVEC，也能杀伤未导入转染tk基因的HUVEC细胞，存在明显的旁观者效应。结论腺病毒介导的KDR－HSV－tk／GCV系统对血管内皮细胞具有特异的杀伤作用及旁观者效应，为抗肿瘤血管靶向治疗奠定了基础。
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腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞旁观者效应的实验研究
目的:研究腺病毒介导的血管内皮因子受体(KDR)启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的旁观者效应.方法: 采用新型腺病毒载体AdEasy系统,构建由KDR启动子调控的、腺病毒介导的、单纯疱疹病毒胸苷酸激酶基因系统(AdKDR-HSV-tk),在人胚胎肾细胞系293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),建立HUVEC/tk转化细胞株.观察丙氧鸟苷(GCV)对HUVEC、 HUVEC /tk细胞的存活率及旁观者效应.结果:从病毒滴度及PCR检查,证实tk基因随病毒的感染已成功地导入293细胞及HUVEC细胞.HUVEC/tk细胞对丙氧鸟苷的敏感性显著高于亲代HUVEC细胞.HUVEC/tk及HUVEC+HUVEC/tk混合细胞还随丙氧鸟苷浓度的增加受到明显的抑制.HUVEC+HUVEC/tk混合细胞的存活率,随HUVEC/tk细胞比例的增加而降低,说明腺病毒介导的KDR启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统不但能杀伤tk+细胞,也能杀伤未导入tk的细胞,存在明显的旁观者效应.结论: 腺病毒介导的KDR启动子单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对血管内皮细胞具有明显的杀伤及旁观者效应.
关键词： KDR启动子 单纯疱疹病毒胸苷激酶 旁观者效应 血管内皮 -
腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用
目的:研究腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用.方法:应用PCR克隆出人KDR基因启动子序列-225 bp～+127 bp,以AdEasy system为载体,构建携带受KDR启动子或CMV启动子调控tk基因表达的2种重组腺病毒质粒pAdKDR-tk和pAdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,并给予不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理,5 d后收集存活细胞并计数.结果:产生的病毒滴度均为5×109pfu/ml.在MOI为100、GCV为50μg/ml条件下,AdKDR-tk转染HUVEC后细胞生存率下降(31.49%±6.42%),AdKDR-tk转染HepG2后细胞生存率为76.57%±3.49%,而转染AdCMV-tk的2细胞系生存率均显著下降,细胞生存率分别为22.24%±3.77%(HUVEC)和26.53%±6.84%(HepG2).结论:KDR基因启动子可调控HSV-tk在血管内皮细胞中特异性表达,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮的自杀基因治疗研究奠定了基础.
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重组腺病毒介导KDRP-CD/TK基因对大肠癌细胞增殖与凋亡的影响
目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人大肠癌细胞LOVO的增殖活性及凋亡的影响.方法 以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的LOVO细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,观察该体系对LOVO细胞的杀伤效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变.结果 重组腺病毒对LOVO细胞及LS174T细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均达约100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的LOVO细胞对前药的具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P均＜0.001).融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均＜0.001).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应.流式细胞术检测表明该体系抑制LOVO细胞DNA的合成,表现为S期阻止.同时,电镜下可见LOVO有凋亡和坏死改变.结论 KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人大肠癌LOVO细胞,其机制与细胞周期阻滞、凋亡及坏死有关.
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KDR启动子介导胸苷激酶体外靶向杀伤血管内皮细胞
目的 构建含以KDR为启动子的HSV-tk重组腺病毒,体外评估其对血管内皮细胞的特异性杀伤效能.方法 采用pAdeasy系统,构建受KDR启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk和AdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞系(HUVEC)和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,用丙氧鸟苷(GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况.结果 病毒滴度均为1×1010 pfu/mL.在感染复数(M0I)为100的条件下,当细胞培养液中加入的GCV浓度由0增至50 μg/mL时,感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞其存活率由100%分别下降至(28.94±5.67)%和(75.45±2.91)%(P＜0.01),而感染含AdCMV-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞其存活率分别下降至(17.56±2.48)%和(23.15±5.72)%(P＞0.05).结论 KDR启动子介导的HSV-tk具有特异性杀伤血管内皮细胞的作用.
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双自杀基因重组腺病毒对SCG7901细胞的体外杀伤作用
目的 探讨KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-KDRp-CDglyTK)对胃癌SCG7901细胞的体外杀伤作用.方法 分别用重组腺病毒Ad-KDRp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染胃癌SCG7901细胞,给予前药5-FC、GCV,测定SCG7901细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应.流式细胞仪检测重组腺病毒Ad-KDRp-CDglyTK和Ad-CMV-CDglyTK分别对SCG7901细胞的细胞周期的变化及凋亡率.结果 与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-KDRp-CDglyTK系统对SCG7901细胞的集落形成、细胞生长均具有更强的抑制作用,并可见较明显的旁观者效应.而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用差异无统计学意义.感染SCG7901细胞的两种腺病毒各自的实验组和对照组之间的细胞周期和凋亡率差异有统计学意义.结论 KDR启动子驱动的双自杀基因治疗系统对胃癌SCG7901细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似.
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AdKDR-CDglyTK系统对结直肠癌细胞及血管内皮细胞的靶向杀伤作用
目的研究腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子受体(KDR)启动子驱动 CD/TK双自杀基因系统对血管内皮细胞及结直肠癌肿瘤细胞的选择性杀伤作用.方法质粒 pAdEasy-KDR-CDglyTK和 pAdEasy-CMV-CDglyTK在 293细胞中包装、扩增后 ,体外感染表达 KDR的 ECV304、 SW620细胞株和不表达 KDR的 LS174T细胞株 ,观察其感染效率并以 RT-PCR方法检测转基因细胞 CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药 5-氟胞嘧啶(5-FC)及更昔洛韦 (GCV)处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应.结果两种病毒滴度均为 2.0× 1012 pfu/ml.两种重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增. RT-PCR方法检测发现:除感染 AdKDR-CDglyTK的 LS174T细胞外,感染 AdCMV-CDglyTK的所有细胞及感染 AdKDR-CDglyTK的其他两种细胞均有目的基因 CDglyTK的表达.该体系治疗结果提示: (1)感染 AdCMV-CDglyTK的所有细胞株和感染 AdKDR-CDglyTK的 ECV304、 SW620细胞对前药具有较高的敏感性 ,且其敏感性差异无显著性意义(均 P >0.05),与前两者相比感染 AdKDR-CDglyTK的 LS174T细胞对前药不敏感(均 P< 0.001); (2)双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(均 P< 0.001); (3)该体系旁观者效应明显.结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达 KDR的血管内皮细胞和结直肠癌肿瘤细胞.
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腺病毒介导双自杀基因选择性杀伤血管内皮细胞
目的研究腺病毒介导的双自杀基因在 KDR启动子调控下对血管内皮细胞的选择性杀伤作用.方法应用 PCR扩增出 KDR启动子序列,分别构建携带 KDR启动子和巨细胞病毒 (CMV)启动子调控下的 CD与 TK的融合基因的重组腺病毒 AdKDR-CDglyTK、 AdCMV-CDglyTK,体外感染脐静脉血管内皮细胞系 HUVEC和结直肠癌细胞系 LOVO细胞,利用重组病毒携带的 GFP基因,在荧光显微镜下观测重组病毒的感染效率,并给予不同浓度的 GCV和 5-氟胞嘧啶 (5-FC),观测杀伤作用,比较两种启动子的转录调控特性.结果成功构建了两种重组病毒,并高效地转染了 HUVEC和 LOVO细胞.两种重组病毒对两种细胞的转染效率相似,并随重组病毒的感染复数 MOI(multiplicity of infection)增加而升高;以 MOI=100的两种病毒分别转染的两种细胞表现出对前药的不同敏感特性:转染了 AdCMV-CDglyTK的 HUVEC和 LOVO细胞以及转染了 AdKDR-CDglyTK的 HUVEC细胞,对前药的敏感性差异无显著性意义( P >0.05);转染了 AdKDR-CDglyTK的 LOVO细胞,对前药敏感性低,与其他 3组比较,差异存在显著性意义(与其他 3组两两间比较, P均 < 0.001).结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因在血管内皮细胞中的特异性表达,有利于实现双自杀基因靶向恶性肿瘤血管内皮细胞的抑癌疗法.
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HSV-tk基因治疗靶向载体的构建及特异性表达分析
背景与目的:阻断肿瘤组织内血管生成和血管化是一个很有发展前景的灭瘤途径之一.胸苷激酶自杀基因系统(herpes simplex virus-thymidinekinase,HSV-tk/GCV)能有效杀伤血管内皮细胞,目前多采用巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)作为启动子,但其杀伤缺乏特异性.KDR(kinase domaininsert containing receptor)是血管内皮生长因子的两种受体之一,它在肿瘤血管内皮细胞中高表达,而在正常组织中呈低表达.本研究是构建KDR启动子介导的HSV-tk重组腺病毒、并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析.方法:采用pAdeasy系统,按定向克隆方法将KDR-tk片段正向插入表达载体的多克隆位点间,构建受KDR启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染人脐静脉血管内皮细胞系(human umbilical venousendothelial cells,HUVEC)和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2.用更昔洛韦(ganciclovir,GCV)处理受染细胞,并以MTF法检测其细胞增殖情况.结果:经限制性酶切分析,RT-PCR及PCR方法鉴定,插入基因大小、位置、方向正确.病毒滴度为1 ×1010 pfu/ml.在感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100的条件下,GCV浓度由0增至50 μg/ml时,感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率由100%分别下降至(28.94±5.67)%和(75.45±2.91)%(P＜0.01).结论:构建的含KDR-tk重组腺病毒可在血管内皮细胞中特异性地表达HSV-tk.
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KDR启动子驱动的双自杀基因对人结肠癌细胞的特异性杀伤作用
目的 探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对人结肠癌细胞SW480的特异性杀伤作用.方法 用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的SW480细胞和不表达KDR的LS174T细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应;用流式细胞术观察细胞内DNA含量和细胞周期的变化.结果 携带双自杀基因和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SW480和LS174T细胞中有GFP表达.RT-PCR检测发现SW480细胞有目的 基因的表达,而LS174T细胞无表达.在前药应用下,已转染腺病毒的SW480和LS174T细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SW480细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应.用流式细胞仪测定给药组出现典型的凋亡峰,细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.结论KDR启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤人结肠癌SW480细胞,抑制其增殖并诱导细胞凋亡.
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KDR-CDglyTK融合基因系统对结肠癌细胞增值的影响
目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人结肠癌细胞SW620增值的影响.方法 重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SW620细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciciovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine).观察该体系对SW620细胞生长增值的影响.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SW620和LS174T细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SW620和LS174T细胞同未转染的各自细胞在细胞生长方面无显著性差异(P>0.05).在前药应用下,已转染腺病毒的SW620和LS174T细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SW620细胞对前药具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01).融合基因的疗效优于单一自杀基因(P<0.01).结论 KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人结肠癌SW620细胞,抑制其增值.
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慢病毒介导的双自杀基因对大肠肿瘤细胞的靶向杀伤作用
目的 研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用.方法 构建的重组FGW-KDRP-CD/TK慢病毒载体在293T细胞包装扩增后,获得病毒颗粒,体外感染表达KDR的LOVO细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应.结果 重组体对各细胞株的感染率相似,RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,LOVO细胞有目的基因CDglyTK的表达.LOVO与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P＜0.001),双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P＜0.001).结论 KDR启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞.
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重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌细胞增值的影响
目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人胃癌细胞SCG7901增值的影响.方法 重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和对照组不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对SCG7901细胞生长增值的影响.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞同未转染的各自细胞在细胞生长方面无显著性差异(P＞0.05).在前药应用下,已转染腺病毒的SCG7901和HepG2细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感(P＜0.01).融合基因的疗效优于单一自杀基因(P＜0.01).结论 KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,抑制其增值.
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AdKDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌MGC-803细胞体的外杀伤作用
目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子第二受体,亦即酪氨酸激酶受体(kinasedomain-containing receptor,KDR)启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人胃癌细胞株MGC-803的杀伤作用.方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MGC-803细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和/或更昔洛韦,观察该体系对MGC-803细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变.结果所得病毒滴度为2.0×1012pfu/ml.MGC-803细胞株感染率随腺病毒滴度的递增而增加.融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P＜0.001).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应.流式细胞术检测表明该体系抑制MGC-803细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P＜0.001).同时,电镜下可见MGC-803细胞有凋亡和坏死改变.结论腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因体系可以有效地杀伤人胃癌细胞.
