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大鼠肝部分切除术后肝窦内皮细胞对肝细胞增生的影响
目的:探讨大鼠肝部分切除术后肝窦血管内皮细胞(LSEC)对再生肝细胞增生的影响.方法:建立Wistar大鼠70%的肝切除模型和肝窦血管内皮细胞、肝细胞分离与培养方法,在术后不同的时相点分离残肝的肝细胞和肝窦血管内皮细胞,进行培养.实验分组:肝部分切除组(PO)和假手术组(SO);肝细胞培养分两组:A组(肝细胞)、B组(肝细胞+LSEC上清液),利用放射免疫法测定肝细胞DNA合成率、免疫组化方法测定肝细胞PCNA表达指数的变化.结果:在术后的6、24 h,B组的肝细胞的PCNA表达指数较A组显著升高(5.9±0.1 vs 8.9±0.1 P＜0.05;38.6±2.6 vs 58.0±3.9 P＜0.01).而且B组肝细胞的DNA合成量较A组显著升高(226±18 vs 8.9±0.1 P＜0.05;38.6±2.6vs 58.0±3.9 P＜0.01).结论:体外实验证实肝部分切除术后肝窦内皮细胞上清可以促进肝细胞的增生,促进肝细胞的DNA合成,增强再生肝细胞增生活性.
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成人原代肝细胞的分离、培养及冻存
目的:建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源.方法:20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞.选择7个不同的预培养时间点（2、6、12、24、36、48和72 h）,分离所获肝细胞按上述不同预培养时间在4℃人无血清培养基(HepatoZYME-SFM)中培养,然后收集预培养肝细胞转移到含100 mL/L胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM中,再立即放入-80℃异丙醇冷冻盒过夜,次日投入液氮,分析比较各肝细胞在解冻后细胞活力率、贴壁率、白蛋白分泌及尿素合成.结果:在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0％±4.6％和72.0％±6.0％.4℃预培养12或24 h被证明是适预培养时间,这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点（P＜0.05）.与立即冷冻组相比较,预培养12或24 h肝细胞解冻后活力(61.4％±4.8％,62.0％±5.6％ vs 53.4％±4.2％)、贴壁率(63.2％±5.8％,62.6％±3.6％ vs 55.2％±4.6％)、白蛋白分泌及尿素合成水平明显提高（均P＜0.05）.结论:人肝细胞在冷冻前4℃预培养12-24 h可以获得较理想的肝细胞,为药理毒理学、生物人工肝以及细胞治疗的临床应用提供了可能性.
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肝细胞移植的新进展
肝细胞移植是继肝移植之后的针对肝功能衰竭的又一有效治疗手段,同时也可以作为急性肝功能衰竭患者等待行肝移植之前的一种桥接治疗手段.与肝移植相比,肝细胞移植具有创伤小、排异反应低等优点,但肝细胞移植同样受到供体短缺的制约.肝细胞移植能否作为一种临床广泛应用的治疗手段主要取决于肝细胞的数量和质量以及合适的移植部位,这方面研究在我国尚未受到充分的重视,因此,本文对肝细胞移植的基础研究与临床应用的新进展作一综述.
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大鼠肝细胞分离及体外损伤模型建立
目的:分离大鼠肝细胞,建立体外大鼠肝细胞损伤模型.方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注分离大鼠肝细胞,培养液中加入不同浓度D-氨基半乳糖培养24 h,于培养1、3、6、12、24 h取上清测定ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸转移酶)、LDH(乳酸盐脱氢酶),同步测定肝细胞的细胞增殖活性(MTT)反应.结果:平均肝细胞产量(8.92±0.47)×108,Trypan blue拒染实验细胞活性率96.23%±2.41%,培养体系中加入D-氨基半乳糖后,部分肝细胞胞膜破损,随剂量增加及时间延长而逐渐加重;各剂量组随时间延长,培养上清液中生化指标水平逐渐升高,而MTT反应水平逐渐下降,以3 h与6 h变化为明显;各时间点生化指标及MTT反应变化随剂量增加呈现相同趋势.结论:该方法可获得高产量高活性大鼠肝细胞;D-氨基半乳糖可成功诱导大鼠肝细胞体外损伤模型.
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原代肝细胞的分离和移植
背景:肝细胞移植可以作为一种桥梁作用,帮助肝功能衰竭患者渡过肝衰期,并提高患者生存率和预后.目的:采用Seglen改良的原位灌注探讨SD大鼠原代肝细胞分离的影响因素和方法的改进,同时分析原代肝细胞治疗急性肝功能衰竭大鼠的疗效.方法:两步法分离大鼠肝细胞.D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭,24 h后分2组:细胞移植组经脾脏移植约2×107个肝细胞;对照组经脾脏注射0.4 mL Hank's液.观察不同时间点大鼠的生存率和血清中转氨酶、总胆红素变化情况、脾内白蛋白分泌作用及脾内肝细胞分布情况.结果与结论:大鼠肝细胞分离存活率达85%~95%.细胞移植组14 d存活率(75%)显著高于对照组组(30%)(P =0.01),且肝功能改善情况明显优于对照组.移植30 d后,脾内有肝细胞白蛋白绿色荧光信号;移植15 d后,可以看到肝细胞在脾脏红髓中簇集在一起并定植.结果说明胶原酶、pH值、灌注液、灌注方法等均是影响肝细胞分离存活率的因素;经脾脏移植的肝细胞能提高急性肝衰竭大鼠的生存率和改善肝功能.
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胶原酶门静脉灌注延缓兔实验性肝硬化的形成
肝硬化是大多数慢性肝病的终末期.目前肝硬化治疗的惟一方法是肝移植,但肝脏供体不足使大量患者得不到治疗.研究表明肝纤维化是可逆的,而肝硬化的逆转并不完全[1].胶原酶门静脉灌注是肝细胞分离的一项技术.本研究试图用有限剂量胶原酶门静脉灌注,降解硬化肝内过多沉积的胶原而不分散或破坏细胞,从而逆转肝硬化.
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NPPB 在大鼠肝细胞分离中的应用效果及其机制
目的：观察5-硝基-2（3-苯丙胺）-苯甲酸（ NPPB）在大鼠肝细胞分离中的应用效果，并探讨其可能的机制。方法将12只SD大鼠随机分为观察组和对照组各6只。两组分离肝细胞后，采用改良的四步胶原酶分离技术进行消化，制备肝细胞悬液。观察组在使用灌注液进行消化的过程中加入NPPB。采用血细胞计数板计算肝细胞收获量，PAS染色后计算纯度，0．4％台盼蓝染色后计算成活率。细胞无血清培养24 h后，采用全自动生化分析仪检测上层清液中的白蛋白（ ALB）、ALT。采用紫外线分光光度法检测LDH吸光度，并计算LDH释放率。采用RT-PCR法检测细胞线粒体氯通道蛋白4（ CLIC4） mRNA 表达， Western blotting 法检测细胞 CLIC4蛋白表达。结果观察组与对照组肝细胞收获量分别为（4．41±0．20）×108、（4．40±0．26）×108个，纯度分别为90％±1％、89％±2％，成活率分别为88％±2％、85％±1％；两组比较，P均＞0．05。观察组与对照组ALB分别为（43．8±5．0）、（25．2±3．0）g／L，ALT分别为（47．8±6．0）、（104．3±11．7）U／L，LDH释放率分别为21．0％±2．7％、34．0％±2．4％；两组比较，P均＜0．05。观察组与对照组CLIC4 mRNA相对表达量分别为1．01±0．02、1．62±0．01，CLIC4蛋白相对表达量分别为0．38±0．02、0．52±0．03；两组比较，P均＜0．05。结论肝细胞分离过程中应用NPPB可以在不影响分离细胞收获量、纯度及成活率的情况下，减轻肝细胞膜结构和功能损伤，其机制可能与抑制CLIC4表达有关。
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成人肝细胞分离及低温保存的研究
我们采用改进的胶原酶灌注技术,获取分离的成人肝细胞,并研究威斯康星(UW)保存液对细胞活力和ATP贮存的影响，现将结果报道如下。 一、材料与方法 1.主要试剂：Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶I、4-2-羟乙基-1哌嗪乙磺(HEPES)均购自 Sigma公司,离解酶(Dispase)Ⅱ型购自Boehringer公司,小牛血清为Gibco产品。 2.分离方法：成人肝脏取自脑死亡供体，采用腹部多器官联合快速切取技术获取, UW液低温灌洗。切取灌洗较好的肝叶组织60～80 g(1个切面,保留3～4支血管行插管),UW液0～4 ℃保存,冷缺血时间3～8 h。肝脏获取后,以1 000 ml 初灌注液20 ml/min灌注,然后以500 ml再灌注液循环灌注至肝脏彻底消化。用镊子撕掉格林森鞘后取出肝细胞放入含体积分数为10%的小牛血清,质量分数为0.01%的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.8 mmol/L Mg2+的1640培养基中混均，尼龙网过滤。然后4 ℃,50 g离心5 min,以含钙的Hanks液漂洗3次。取细胞悬液台盼兰染色判断细胞存活率(灌注液成分见表1) 。 3.UW液保存：肝细胞悬液50 g离心后去上清,均匀悬于UW液中(含胰岛素 4 IU/L, 地塞米松 16 mg/L,血清及青霉素),4 ℃保存,一定时间后测细胞存活率, HPLC法测细胞内 ATP,生化法测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。在相应时段取细胞37 ℃水浴中孵育60 min,然后测细胞内ATP。 4.统计学方法：数据以均数±标准差(****±s)表示,采用t检验。 二、结果 肝细胞活力及ATP含量见表2。 三、讨论 我们应用改进的胶原酶循环灌注方法获得了纯度及存活率均较高的成人肝细胞。在切取肝叶前以UW液低温灌洗肝脏,灌注前全身肝素化, 大大减少了肝组织中红细胞的数量,初灌注时应用含乙二醇四乙酸的无钙Hanks液,提高了肝细胞的产量。灌注时用透明质酸酶,使得肝脏基质消化得更彻底, 再灌注时应用DNA酶Ⅰ及离解酶Ⅱ,可以消化坏死的肝细胞释放的DNA，使消化后的肝细胞不能凝结成块。再灌注液中含有Mg2+和Ca2+,可以稳定DNA酶，以发挥更大效果。肝脏灌注过程中产生的一些酸性产物可使灌注液的pH值下降到6.0左右,灌注液中的多数酶发挥作用的佳pH值为7.4,我们在本研究中采用15 mmol/L的H EPES作为缓冲系,可使灌注液的pH值恒定在7.4～7.5之间,而且对肝细胞的毒性很小［1］，以使各种酶类发挥佳消化效果。肝细胞消化完全后格林森鞘很容易撕去,如过度消化则可崩解成碎片。经过以上处理, 可以得到纯度及存活率均较高的肝细胞用于各种研究。
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低温保存人肝细胞Na+/H+交换与细胞内钙和细胞活力的关系
我们通过阻滞Na+/H+交换,观察低温保存肝细胞Na+/H+通道的特点及其对细胞内Ca2+和细胞存活率的影响,现将结果报道如下。 一、材料和方法 1. 试剂:Ⅱ型胶原酶,透明质酸酶,DNA酶Ⅰ,阿米洛利(A)购于Sigma公司,离解酶Ⅱ型购自Boehringer公司。 2. 肝细胞分离及保存:按照Seglen［1］的方法并做改进。肝脏获取后,以1 000 ml含乙二醇四乙酸(EGTA)0.5 mmol/L的Hanks液以每支管20 ml/min的速度灌注。然后改以500 ml含Ca2+、Mg2+,15 mmol/L的4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES),0.5 mmol/L的Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶的Hanks液循环灌注至肝脏彻底消化,小心取出肝细胞放入含体积分数为10%小牛血清,0.01%DNA酶I,0.01%Ⅱ型离解酶及0.08 mmol/L的Mg2+的1640培养基中混均,过滤。然后4℃,50 g离心5 min,以含钙的Hanks液漂洗至少3次。取细胞悬液台盼蓝染色判断细胞存活率。离心后肝细胞悬液均匀悬于高Na+保存液(高Na+保存液配方为：NaCl 137 mmol/L；KCl5.40 mmol/L；KH2PO40.44 mmol/L；NaH2PO41.34 mmol/L；MgSO40.83 mmol/L；CaCl21.67 mmol/L；葡萄糖10 mmol/L；半乳糖5 mmol/L；NaHCO3 10 mmol/L；HEPES 20 mmol/L；青霉素0.1 g/L；丙酮酸盐5 mmol/L)中低温保存。实验组加1 mmol/L的阿米洛利。分别于0、15、30 min、1、2、6、12 h取肝细胞行细胞内Na+、Ca2+及细胞存活率的检查。
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内毒素对体外培养的肝细胞凋亡相关基因表达的影响
内毒素（lipopolysaccharide，LPS）在体外可以诱导肝细胞发生凋亡[1]。细胞凋亡的发生发展与许多凋亡相关基因表达的改变有密切的关系。 1. 材料与方法：采用Seglen法将雄性Wistar大鼠的肝细胞分离后培养24h。在培养基中直接加入LPS 10mg/L，分别在3h、6h、12h、和24h收集肝细胞，同时设正常对照组。用Moore等[2]的方法提取培养细胞的DNA片段。一步法提取RNA。半定量RT-PCR法检测在不同时间点基因PCR产物的含量。
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肝细胞简易分离、培养和鉴定方法初探
长期以来,Guguen等[1]的两步胶原酶灌注法分离获得肝细胞的方法,几乎成了肝细胞分离的经典方法;在此基础上又发展了多种不同的培养方法,如在培养瓶内加纤连蛋白(febronectin)以促进肝细胞附壁[2],添加生长因子于培养基促其生长等.但上述方法步骤繁琐,成本较高,且两步胶原酶灌注法主用于大鼠肝细胞的分离,不适于新生鼠肝细胞的分离,甚至分离成年小鼠肝细胞,都因为血管的纤细,在实际应用中也很困难.
