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急性乙醇暴露对人原代肝细胞血红素氧化酶的影响
目的 研究急性乙醇暴露对人原代肝细胞血红素氧化酶活力及蛋白水平的影响.方法 经体外灌流、分离培养人原代肝细胞,观察乙醇对人原代肝细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶(AST)的释放及谷胱甘肽(GSH)含量的变化,用western blot方法 检测乙醇对人原代肝细胞血红素氧化酶活力及蛋白水平的影响.结果 急性乙醇暴露导致人原代肝细胞上清液中释放的AST增加,并呈明显的剂量效应和时间效应关系;此外,在100mmol/L乙醇24h暴露下,肝细胞中的GSH明显降低,而HO-1酶活力在0.5～12h之间明显升高,随后开始降低,且HO-1蛋白水平变化趋势与此一致.结论 HO-1酶活力的升高可能与乙醇暴露下人原代肝细胞氧化损伤的保护有关.
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肝细胞移植:临床应用及实验室研究
肝细胞移植(hepatocytes transplantation,HCT)为损伤肝脏的细胞重建及衰竭肝脏的功能恢复提供了一种全新的治疗.其目的一方面要改变整体器官移植的形式,即:由一个供体仅能供给一个受体形式变为由一个供体移植给几个受体[1],近,我们在国内率先将人原代肝细胞移植应用于临床,实现了不经整体肝移植而重建肝功能或桥梁治疗使肝衰竭患者等到供体肝脏[2,3];另一方面对遗传性肝脏代谢性疾病可通过新分离的肝细胞或基因修正的肝细胞做肝脏直接的基因治疗.我国人数较多的重型肝炎和肝衰竭患者为肝细胞移植的临床应用展现了广阔的应用前景.
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成人原代肝细胞的分离、培养及冻存
目的:建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源.方法:20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞.选择7个不同的预培养时间点（2、6、12、24、36、48和72 h）,分离所获肝细胞按上述不同预培养时间在4℃人无血清培养基(HepatoZYME-SFM)中培养,然后收集预培养肝细胞转移到含100 mL/L胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM中,再立即放入-80℃异丙醇冷冻盒过夜,次日投入液氮,分析比较各肝细胞在解冻后细胞活力率、贴壁率、白蛋白分泌及尿素合成.结果:在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0％±4.6％和72.0％±6.0％.4℃预培养12或24 h被证明是适预培养时间,这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点（P＜0.05）.与立即冷冻组相比较,预培养12或24 h肝细胞解冻后活力(61.4％±4.8％,62.0％±5.6％ vs 53.4％±4.2％)、贴壁率(63.2％±5.8％,62.6％±3.6％ vs 55.2％±4.6％)、白蛋白分泌及尿素合成水平明显提高（均P＜0.05）.结论:人肝细胞在冷冻前4℃预培养12-24 h可以获得较理想的肝细胞,为药理毒理学、生物人工肝以及细胞治疗的临床应用提供了可能性.
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药物对人肝CYP450酶诱导和抑制作用体外评价体系的建立与验证
建立药物对CYP450酶诱导与抑制作用的体外评价方法并进行验证.LC-MS/MS法测定人肝微粒体CYP450酶7种主要亚型的8个底物代谢产物;在优化的温孵条件下,底物法测定人肝微粒体CYP450酶的活性;应用已知抑制剂对所建立的温孵体系进行验证.LC-MS/MS法测定人肝细胞CYP450酶3种主要亚型的底物代谢产物;底物法测定人原代肝细胞CYP450酶的活性,同时收集温孵后的人肝细胞,应用Taqman荧光探针法测定主要亚型mRNA的表达量;应用已知诱导剂对所建立的温孵体系进行验证.建立的LC-MS/MS分析方法符合生物分析要求;已知抑制剂和诱导剂在本实验温孵体系下均表现出明显的抑制作用或诱导作用.建立的实验方法准确、可靠,可用于体外评价药物对CYP450酶的诱导或抑制作用.
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丹红注射液对人原代肝细胞尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的体外抑制作用
目的 研究丹红注射液对Ⅱ相药物代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)的体外抑制作用.方法 随机将新鲜的人原代肝细胞分为3组:实验组(丹红注射液)、阳性对照组(酮康唑)和空白对照组.分别将7个不同含量的丹红注射液(0.14％,0.41％,1.23％,3.70％,11.10％,33.30％和100.00％)、不同浓度的酮康唑溶液(1.37,4.12,12.30,37.00,111.00,333.00和1000.00μmol·L-1)10 μL和纯化水与探针底物7-羟基香豆素(1000 μmol·L-1)10置于人原代肝细胞体外孵育体系80 μL中,共同孵育15 min.用液相色谱-串联质谱法测定代谢产物7-羟基香豆素-D-葡萄糖醛酸苷的含量(代表UGTs活性),并计算其IC50值(表示丹红注射液对UGTs的抑制程度).结果 含量分别为0.00％,0.01％,0.04％,0.12％,0.37％,1.11％,3.33％和10.00％的丹红注射液(在孵育体系中稀释了10倍)对UGTs的抑制率分别为0,-1.6％,3.2％,8.2％,5.2％,17.1％,38.3％和71.4％,且呈浓度依赖性抑制作用.与空白对照组比较,1.11％,3.33％,10.00％的丹红注射液差异均有统计学意义(P＜0.05).在人原代肝细胞体外孵育体系中,丹红注射液对UGTs的IC50值为4.9％.结论 丹红注射液对人原代肝细胞UGTs有较弱的抑制作用,不太可能导致与UGTs相关的药物相互作用.
关键词： 丹红注射液 人原代肝细胞 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 抑制作用 药物相互作用 -
白藜芦醇诱导HO-1对酒精性肝细胞的保护作用
目的 白藜芦醇(resveratrol)是非黄酮类的多酚化合物,具有多种有益的生物学效应.本研究目的 观察白藜芦醇对酒精导致的人原代肝细胞损伤的保护作用及机制.方法 经体外灌流、分离培养人原代肝细胞.测定白藜芦醇20μmol/L对酒精致肝细胞LDH释放率的影响.人原代肝细胞给予不同受试物(100mmol/L酒精,20μmol/L白藜芦醇,25μmol/L Znpp9(锌原卟啉Ⅸ:zinc protoporphyrin-Ⅸ)24h,观察HO-1酶活性变化,孵育上清液AST,LDH释放水平,肝细胞内MDA,GSH含量变化.结果 白藜芦醇可显著升高酒精致肝细胞LDH释放率的EC50(从700mmol/L上升至1050mmol/L);白藜芦醇可使肝细胞HO-1酶活性明显增加,并可显著抑制酒精导致的肝细胞AST,LDH释放,降低肝细胞内MDA水平,提高GSH含量.但是HO-1抑制剂Znpp9却明显降低了白藜芦醇对酒精导致的肝细胞损伤的保护作用.结论 白藜芦醇对酒精导致的人肝细胞损伤具有保护作用,这种保护作用与其诱导的HO-1酶活性升高有关.
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急性酒精暴露对人原代肝细胞HO-1 mRNA表达的影响
目的: 研究急性酒精暴露对人原代肝细胞HO-1 mRNA表达的影响. 方法: 经体外灌流、分离培养人原代肝细胞,观察酒精对人原代肝细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶(AST)的释放及GSH含量的变化,用RT-PCR方法检测酒精对人原代肝细胞HO-1 mRNA的表达. 结果: 急性酒精暴露导致人原代肝细胞上清液中释放的AST增加,并呈明显的剂量效应和时间效应关系;此外,在100 mmol/L 乙醇24 h暴露下,肝细胞中的GSH明显降低,HO-1 mRNA表达开始明显增加,3～9 h之间达到高峰,随后开始降低. 结论: 在25～100 mmol/L范围内,急性酒精暴露导致人原代肝细胞明显的氧化损伤,且影响HO-1 mRNA表达.
关键词： 酒精 人原代肝细胞 HO-1 mRNA表达 -
永生化人肝细胞系的建立及其生物学特性
目的 建立一种由慢病毒载体表达人端粒酶反转录酶亚单位,具有原代肝细胞的特性的永生化肝细胞系.方法 采用离体两步胶原酶灌注法无菌条件下分离肝细胞,构建慢病毒载体并包装高滴度慢病毒,肝细胞被采用表达永生化基因的慢病毒转染.通过筛选功能基因阳性表达克隆建立永生化肝细胞系,倒置相差显微镜观察形态学变化,免疫组化检测细胞角蛋白18(CK18)表达,RT-PCR及Westernblot检测功能基因及蛋白表达.结果 采用功能基因阳性表达筛选建立了永生化肝细胞系,其可连续扩增传代,具有原代肝细胞的特性并未呈现致瘤性,揭示出肝脏实质细胞的形态学特征并且表达肝细胞主要的功能基因标志.结论 通过功能基因阳性表达筛选成功建立具有原代肝细胞特性的永生化肝细胞系.
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丹红注射液对3种转运体的体外抑制作用研究
目的:初步研究丹红注射液对药物转运体Na+-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)、有机阴离子转运多肽(OATP)和有机阳离子转运体1(OCT1)的体外抑制作用.方法:将新鲜的人原代肝细胞随机分为3组:实验纽(7个不同含量的丹红注射液0.03％、0.06％、0.12％、0.25％、0.50％、1.00％和2.00％),NTCP、OATP和OCT1分别对应的阳性药物(环孢素A溶液10 μmol/L、利福霉素200 μmol/L、维拉帕米溶液20 μmol/L)对照组和空白对照组(汉克斯平衡盐溶液),分别取160μL工作溶液置于人原代肝细胞体外孵育体系中预孵育15 min,再加入三合一底物40 μL(牛胆磺酸钠5 μmol/L、瑞舒伐他汀5μmol/L和1-甲基4-苯基吡啶离子5 μmol/L)共同孵育.用液相色谱-串联质谱法测定细胞裂解液中代表转运体活性的底物含量,并计算其IC50值.结果:在人原代肝细胞体外孵育体系中,0.12％,0.25％,0.50％,1.00％和2.00％的丹红注射液对OATP的抑制作用与空白对照组相比,差异均具有统计学意义(P＜0.05,P ＜0.01,P ＜0.01,P ＜0.01,P＜0.01).丹红注射液对药物转运体NTCP、OATP和OCT1的IC50值分别为≥2.00％、0.85％和＞2.00％,且对OATP的IC50值(0.85％)介于常用日剂量之间.结论:丹红注射液在体外对人原代肝细胞NTCP和OCT1有较弱的抑制作用,不太可能导致与它们相关的药物相互作用;但是对OATP有较强的抑制作用,提示我们当丹红注射液与其他经OATP转运的药物联用时,要注意药物间的相互作用,避免可能产生的不良反应.
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HBV适应性杂交细胞株的建立和初步研究
目的 方法诱导HepG2细胞产生HGPRT基因突变,将筛选出的HGPRT阴性的HepG2细胞与携带HBV的人原代肝细胞进行融合得杂交细胞,用HAT培养基筛选出异核体杂交细胞,再利用有限稀释法进行克隆,通过核型分析方法鉴定所得细胞.对所得杂交细胞及培养上清液进行HBV DNA和HBsAg、HBeAg的检测.实验同时,用未杂交的HepG2和人原代肝细胞作对照.结果 经筛选后,有一杂交细胞株(HepCHLine3)克隆成功.HepCHLine3在形态学上与HGPRT-HepG2细胞相似,能体外传代培养,染色体核型分析示HepCHLine3杂交细胞染色体众数为99条,证明为融合细胞株,含所有来自HepG2和人原代肝细胞的基因数.传代培养的HepCHLine3和其培养上清液用巢式PCR分别可检测到HBV DNA,培养上清液内检测到HBsAg和HBeAg.对照组的HepG2和人原代肝细胞相应结果为阴性.提示该细胞携带并分泌HBV DNA.结论 该杂交细胞兼具HepG2细胞体外传代和人原代肝细胞对HBV易感的特性,是一新型杂交细胞系,为进一步建立新型HBV感染细胞模型奠定了基础.
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HBV携带者肝细胞体外培养的研究
目的:体外培养HBV携带者人原代肝细胞,研究细胞内HBV的复制情况及持续时间,为临床抗病毒试验治疗奠定基础.方法:分离HBV携带者人原代肝细胞进行体外培养.14 d后,测绘细胞的生长曲线和细胞核型分析.分别用巢式PCR和ELISA法对细胞匀浆及培养上清液进行HBV-DNA和HBsAg、HBeAg的检测.结果:HBV携带者人原代肝细胞和培养上清液可检测到HBV-rcDNA,培养上清液内检测到HBsAg和HBeAg.细胞培养3周时开始出现大量死亡.结论:该细胞体外培养期间仍能保持对HBV感染和复制的特性,为体外研究HBV感染情况奠定了基础.
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原代培养人肝细胞体外乙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒表面抗原黏附模型初探
目的 研究建立人肝细胞体外乙型肝炎病毒(HBV)感染模型和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)黏附模型,为后期研究小分子抗体Fab的作用打下基础.方法 体外原代培养人肝细胞,对人原代肝细胞进行HBsAg黏附实验及HBV感染实验.采用正常人胎肝细胞系(L-02)及鼠原代肝细胞进行实验对照.倒置相差显微镜下观察细胞形态,生化法检测其白蛋白分泌功能.免疫组化法检测HBsAg黏附情况和HBV感染肝细胞内HBsAg的表达.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝细胞感染HBV后HBsAg的持续表达.PCR检测肝细胞内HBV复制中间体-闭合环状双链DNA(cccDNA).结果 人原代肝细胞体外培养达2周以上.HBsAg黏附实验检测到HBsAg可黏附于人原代肝细胞、L-02、鼠原代肝细胞胞膜.HBV体外仅感染人原代肝细胞,从第2天起即可检测到细胞培养上清中存在HBsAg,并持续到观察结束第16天,免疫组化检测人原代肝细胞内HBsAg呈阳性;PCR检测到人原代肝细胞内存在HBV-cccDNA,而L-02及鼠原代肝细胞实验检测结果均为阴性.结论 人原代肝细胞体外分离培养成功,HBsAg黏附和HBV感染模型初步建立于人原代肝细胞.
关键词： 人原代肝细胞 乙型肝炎病毒表面抗原 乙型肝炎病毒 感染 -
体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究
目的 通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源.方法 采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存.复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定.结果 复苏后,肝细胞存活率达到(71.6±2.2)％,相较新鲜分离的肝细胞,存活率达到90％以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白(ALB)、谷氨酰胺合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)以及细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)功能基因表达无统计学差异(P＞0.05).结论 初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础.
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一种转导人原代肝细胞的LV-HBx诱导调控表达系统
目的:建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响.方法:采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率.应用该系统制备LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒共同转导肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,再加入强力霉素(Dox)诱导调控HBx表达,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测人原代肝细胞中肿瘤转移相关基因1(MTA1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)、上皮型钙黏附素1(CDH1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)mRNA的表达水平.结果:重组慢病毒-HBx表达系统构建成功,LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒用量配比经过优化,采用1:1或2:1转导后可达到较高的表达效率,Dox诱导产生的表达HBx的阳性细胞率分别为67.3%和66.7%.应用该系统将HBx基因转导入肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,可用Dox进行诱导调控HBx的高效表达.其中人原代肝细胞中Dox诱导组的HBx表达水平约为对照组(不加Dox诱导)的45倍,经qPCR检测高表达HBx的人原代肝细胞中MTA1、VEGFA、TGFB1 mRNA的表达水平较对照组均显著升高(P均<0.05),而CDH1、IGFBP3 mRNA表达水平显著降低(P均<0.05).结论:成功建立了转导人原代肝细胞的LV-HBx四环素诱导调控表达系统,该系统的建立为研究HBx等乙肝病毒基因对人原代肝细胞的影响打下了基础.
