首页 > 文献资料
-
神经酰胺诱导人结肠癌细胞凋亡作用
目的探讨外源性神经酰胺诱导人结肠癌HT-29细胞的凋亡作用.方法采用光镜、电镜、荧光显微镜和琼脂糖凝胶电泳方法检测C2-神经酰胺诱导HT-29细胞凋亡.MTT法检测C2-神经酰胺对HT-29细胞线粒体功能的影响.结果 C2-神经酰胺使HT-29细胞发生核染色质断裂、DNA Ladder、凋亡小体等典型凋亡表现,12和24h凋亡细胞率分别为64.1%和81.3%,呈现时间-剂量依赖关系.同时C2-神经酰胺处理细胞6 h后,细胞线粒体功能即出现损伤.结论外源性神经酰胺能诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,参与其凋亡调控.
-
神经酰胺诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的研究
目的 探讨外源性神经酰胺诱导人结肠癌HT-29细胞的凋亡作用及对Bcl-2家族蛋白基因表达的影响.方法 不同浓度C2-神经酰胺处理HT-29细胞,采用Hoechest荧光染色和琼脂糖凝胶电泳方法检测细胞凋亡,RT-PCR方法检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad和Bid基因表达水平.结果 C2-神经酰胺诱导HT-29细胞发生核染色质断裂、出现凋亡小体等典型凋亡改变,50μmol/L神经酰胺作用12和24小时凋亡细胞率分别达到64.7%和81.3%.同时神经酰胺使Bax、Bad和Bid基因表达水平增高,使Bcl-2和Bcl-xl基因表达水平减弱,Bcl-2与Bax比值下降,呈现剂量-效应关系.结论 外源性神经酰胺能通过上调或下调Bcl-2家族基因表达水平诱导人结肠癌HT-29细胞发生凋亡.
-
槲皮素对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响
目的 研究槲皮素对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响,并探讨其对肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor factor 6,Traf6)/转化生长因子β激活酶1(transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1)信号通路的调控作用.方法 将细胞按随机数字表法分为对照组、16μg/ml槲皮素组、Traf6抑制剂组、16μg/ml槲皮素+Traf6抑制剂组,对照组常规培养,其余各组加入16μg/ml槲皮素和/或Traf6抑制剂20 nmol/L进行干预.培养24 h,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,采用免疫印迹法检测Traf6/TAK1信号通路蛋白及caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)及Bcl-2表达,采用RT-PCR技术检测Traf6 mRNA表达.结果 与16μg/ml槲皮素组比较,16μg/ml槲皮素+Traf6抑制剂组Traf6[(0.59±0.03)比(0.96±0.04)]、p-TAK1[(0.43±0.02)比(0.72±0.04)]、caspase-3[(0.59±0.03)比(0.70±0.04)]、Bax[(0.48±0.03)比(0.67±0.04)]表达降低,Bcl-2[(0.54±0.03)比(0.44±0.02)]表达升高(P<0.05),Traf6 mRNA[(0.38±0.24)比(0.82±0.08)]表达降低(P<0.05).结论 槲皮素可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与激活Traf6/TAK1信号通路有关.
-
鞘氨醇激酶1对结肠癌细胞血管生成拟态的影响及其机制
目的:研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,Sphk1)对人结肠癌HT-29细胞生成血管拟态(vasculogenic mimicry,VM)的影响及其可能的机制.方法:将人结肠癌HT-29细胞分为Sphkl抑制组、Sphk1激活组、对照组.Sphk1抑制组加入N,N-二甲基鞘氨醇(N,N-dimethyl-D-erythro-sphingosine,DMS)50 μmol/L; Sphk1激活组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate-13-acetate,PMA)100nmol/L;对照组加入等量的培养基.采用MTT法检测细胞生长增殖；透射电镜观察细胞形态学变化；Matrigel三维培养法观察VM形成能力；Transwell小室模型观察细胞侵袭迁移能力的变化,QT-PCR、Western blot及ELISA技术检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达.结果:DMS显著抑制细胞的增殖、侵袭、迁移并促进细胞凋亡；透射电镜可见典型的凋亡特征；三维培养中不能形成管状VM;明显减弱VEGF mRNA及蛋白表达.PMA则显著促进HT-29细胞的增殖、侵袭、迁移并抑制细胞的凋亡；透射电镜可观察到细胞增殖特征；促进三维培养中管状VM的形成；明显增强VEGF mRNA及蛋白表达.对照组、DMS组及PMA组的侵袭细胞数:112.00±6.25 vs 57.00±8.00,142.00±5.57;迁移细胞数:69.33±4.04 vs 42.00±4.16,111.00±8.03; VEGF mRNA表达量:1.000 vs 0.740±0.122,1.220±0.075; VEGF蛋白表达:0.39±0.05 vs 0.23±0.02,0.65±0.06; VEGF蛋白分泌:103.00±8.96 vs 63.89±8.44,201.01±17.93,均P＜0.05.结论:Sphk1可促进HT-29细胞增殖、侵袭、迁移并抑制细胞的凋亡,诱导VM的形成,其机制可能是通过增强结肠癌细胞的侵袭迁移能力并促进VEGF表达而发挥作用.
-
四株人结肠腺癌细胞CEA表达水平的检测及其意义
目的:检测四株结肠癌细胞株中癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的表达,并探讨其意义.方法:四株人结肠腺癌细胞(LS174T,LoVo,SW480及HCT-8)分别应用ELISA法测定细胞培养上清中CEA含量;免疫组化检测细胞CEA蛋白表达;半定量RT-PCR检测细胞CEAmRNA表达丰度.结果:LS174T和SW480细胞在蛋白和mRNA水平均可检测到CEA的表达且前者表达量高于后者(细胞培养上清中CEA含量:1050±25.0ng/107 cells vs 66±5.6 ng/107 cells,P＜0.0001;半定量检测CEA mRNA表达丰度:1.137±0.155 vs 0.399±0.135,P=0.003);而LoVo细胞在蛋白和和mRNA水平均未检测到CEA的表达;HCT-8细胞免疫组化有弱阳性染色.结论:四株结肠癌细胞株的实际CEA表达情况与既往文献报道不尽相同.这种细胞株CEA表达特性的改变有可能影响其体外生物学行为从而导致实验结果的不确定性.
-
蛋白激酶C-δ阻断剂Rottlerin对人结肠癌细胞的影响及其机理
目的 研究蛋白激酶C-δ(PKC-δ)阻断剂Rottlerin对人结肠癌细胞的影响及其机理.方法 培养人结肠癌细胞SW1116,以Rottlerin 10 μmol/L干预24 h,并以DMSO为对照.以定量RT-PCR检测DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)1、3a、3b和抑癌基因APC、p21WAF1和p16INK4A基因转录水平;流式细胞仪分析细胞周期;光学显微镜下观察细胞形态学变化.结果 PKC-δ阻断剂Rottlerin可抑制Dnmt1和Dnmt3a表达,上调APC、p21 WAF1和p16INK4A转录;Rottlerin明显增加G0/G1期细胞百分比(P=0.02),显著降低G2/M期细胞百分比(P=0.01);Rottlerin可使细胞胞浆增加,体积增大,细胞变得肿胀,轮廓模糊,细胞核分裂相明显减少.结论 PKC-δ阻断剂Rottlerin通过调控DNA甲基化水平以及阻断MAPK途径,抑制结肠癌SW1116细胞分裂、增殖.
关键词： 蛋白激酶C-δ阻断剂 Rottlerin 人结肠癌细胞 -
活化Notch1信号下调Wnt信号抑制结肠癌细胞增生
目的 构建重组反转录病毒载体pCLNRX-ICN,研究过度活化Notch1信号对人结肠癌细胞HT-29细胞增生的影响作用及机制.方法 将人Notch1基因胞内区(ICN)克隆至反转录病毒载体pCLNRX中,与包装载体pCL-10A1共转染293细胞,制备重组病毒上清,检测病毒效价.MTT法检测稳定表达外源性ICN对细胞生长的影响,RT-PCR及Western Blot检测c-Myc、β-catenin表达水平.结果 成功构建重组反转录病毒载体pCLNRX-ICN,通过共转染获得了具有较高效价的重组反转录病毒.通过表达外源性ICN而过度活化Notch1抑制HT-29的生长,并下调Wnt信号途径关键调控分子β-catenin的蛋白表达水平,但对β-catenin的mRNA水平未见明显影响.而且过度活化Notch1对c-Myc的蛋白及mRNA表达水平均无明显影响. 结论 过度活化Notch1信号部分通过下调Wnt信号而抑制HT-29的生长,且该作用不依赖c-Myc的抑制.
-
蓝莓提取物对人结肠癌细胞的体外抑制作用及机制研究
目的 研究蓝莓提取物对人结肠癌细胞株HCT116增殖的体外抑制作用及其机制.方法 应用不同浓度梯度蓝莓提取物处理人结肠癌HCT116细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测肿瘤细胞增殖情况,应用流式细胞术检测蓝莓提取物对HCT116细胞体外凋亡情况影响,并进一步研究了Caspase-3活性以及NF-κB表达变化情况以探讨相关机制.结果 蓝莓提取物对HCT116细胞的增殖抑制作用呈现明显的剂量及时间效应关系;流式细胞仪检测显示各浓度(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)蓝莓提取物处理组HCT116细胞平均凋亡率分别为(8.86±1.03)%、(16.33±1.99)%、(49.29±6.73)%、(63.68±8.26)%,除0.25 mg/L组外,均显著高于对照组的(6.62±0.97)%;1.00 mg/L蓝莓提取物还可显著升高肿瘤细胞中Casepase-3活性,抑制NF-κB表达.结论 蓝莓提取物可能通过激活Casepase-3级联反应通路和抑制NF-κB表达,诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡从而抑制其体外的生长与增殖.
-
RNAi下调FAK基因对大肠癌细胞SW620侵袭及转移能力的影响
目的：观察应用RNAi技术下调局部粘着斑激酶(FAK)基因表达对SW620细胞侵袭及转移能力的影响。方法利用前期构建的针对FAK基因有效的短发夹RNA (shRNA )序列的慢病毒表达载体，包装慢病毒并感染人结肠癌细胞SW620。运用免疫印记(Western-blot)从蛋白水平检测FAK基因的表达， Transwell小室模型分别检测敲减FAK基因表达对SW620细胞的侵袭及转移能力的影响。结果用慢病毒敲减FAK后的大肠癌细胞，蛋白水平FAK表达明显下调， SW60细胞的侵袭及转移能力均受到明显抑制。结论下调FAK的表达水平，能明显抑制大肠癌SW620细胞的侵袭及转移能力。
-
TIMP1基因对人结肠癌HCT-8细胞增殖影响的研究
目的 采用体外试验探讨基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因对人结肠癌(HCT-8)细胞增殖的影响.方法 构建TIMP1基因的真核表达载体和RNA干扰质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K、TIMP1 RNAi、pcDNA3.1和空白对照),将TIMP1基因真核表达质粒和RNA干扰质粒分别瞬时转染入HCT-8细胞48～72h后,采用Real TimePCR方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中基因转录表达水平,并用Western blot方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中蛋白表达水平,采用MTr试验检测TIMP1基因过表达和干扰后对HCT-8细胞增殖的影响.结果 成功构建了TIMP1真核表达质粒和RNA干扰质粒.与空白对照比较,质粒pcDNA3.1-TIMP1-K在HCT-8细胞中mRNA和蛋白的相对表达含量较高,质粒TIMP1 RNAi的mRNA和蛋白表达含量较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).构建过表达质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞的活性无显著变化(P＞0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够促进HCT-8细胞的增殖活性(P＜0.05)；构建干扰质粒(TIMP1 RNAi)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞生长无显著变化(P＞0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够抑制HCT-8细胞增殖(P＜0.05).结论 TIMP1基因过表达后能够促进人结肠癌细胞的增殖,在一定条件下还能够抑制人结肠癌细胞的增殖.
关键词： 基质金属蛋白酶抑制剂1 人结肠癌细胞 增殖 -
矢车菊素-3-葡萄糖苷在Caco-2细胞模型的吸收机制研究
目的 研究花色苷矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-G)在Caco-2细胞模型的吸收机制.方法 建立Caco-2单层细胞模型,观察Cy-3-G的转运情况.加入不同浓度的维拉帕米(P-gp抑制剂)、MK571(MRP2抑制剂)、根皮苷(SGLT1抑制剂)及根皮素(GLUT2抑制剂),观察P-gp、MRP2、SGLT1及GLUT2等转运蛋白在Cy-3-G肠道吸收中的作用.结果 Cy-3-G在Caco-2细胞模型的吸收率随着时间延长逐渐升高,2h时吸收率在0.76％～2.41％之间,但随着花色苷浓度的升高而降低.维拉帕米和MK571对Cy-3-G在Caco-2细胞模型的吸收无影响(P＞0.05),根皮苷和根皮素可显著抑制Cy-3-G的吸收(P＜0.05).结论 P-gp和MRP2对Cy-3-G在肠道的吸收无影响,SGLT1和GLUT2均参与了Cy-3-G在小肠的吸收.
关键词： 矢车菊素-3-葡萄糖苷 人结肠癌细胞 吸收机制 高效液相色谱串联质谱 -
萝卜硫素对人结肠癌HT-9细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响
[目的]研究萝卜硫素对人结肠癌HT-9细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制.[方法]采用CCK8试剂检测萝卜硫素对HT-9细胞增殖的影响;碘化丙啶(PI)染色检测萝卜硫素对HT-9细胞凋亡的影响;免疫印迹法检测PI3K/Akt信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达.[结果]萝卜硫素可以明显抑制HT-9细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性;PI染色结果提示萝卜硫素可明显诱导HT-9细胞的凋亡,10、20、40 μg/mL萝卜硫素作用24 h后,HT-9细胞的凋亡率分别为(14.67±1.95)%、(27.95±2.53)%及(35.6±3.75)%,并且让细胞停留在G0/G1期;Western Blot结果提示萝卜硫素呈剂量依赖性的抑制PI3K、p-Akt及Bcl-2蛋白的表达,并诱导Bax蛋白的表达.[结论]萝卜硫素可明显抑制HT-9细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路的活化有关.
-
鲨鱼软骨制剂对人结肠癌细胞增殖抑制作用的研究
目的:研究鲨鱼软骨制剂 (SCP) 对人结肠癌细胞生长、抑制效应,探讨其抗癌作用机制.方法:用不同浓度的SCP加入体外培养的人结肠癌细胞(THC8908)中,观察加药后细胞生长和有丝分裂指数(MI)的变化;用MTT法检测其细胞毒作用; Hoechst 33342/PI荧光双染色方法检测细胞凋亡.结果:SCP明显抑制THC8908细胞生长; IC50值为1 mg/ml;MI于加药后48小时较对照组明显降低;凋亡细胞比例在用药后48小时达78.85%.结论:SCP可有效抑制人结肠癌细胞的增殖.
-
大黄素抑制人结肠癌RKO、Caco-2细胞体外增殖作用的研究
目的:探讨大黄素对人结肠癌细胞株RKO、Caco-2的体外增殖的抑制作用.方法:MTT比色法检测细胞活力；倒置显微镜显像观察细胞数量变化；FCM检测细胞凋亡率及周期分布；Caspase-3分光光度法检测Caspase-3酶蛋白活性.结果:随着作用时间的延长以及大黄素浓度的升高,大黄素对人结肠癌RKO、Caco-2细胞的体外增殖抑制作用增高；大黄素阻滞两种细胞于S期,使G2/M期细胞比率明显下降,激活Caspase-3酶蛋白；提高细胞凋亡率.结论:大黄素抑制人结肠癌细胞株RKO、Caco-2体外增殖,其作用呈浓度、时间依赖性；大黄素能够阻滞RKO、Caco-2细胞株细胞周期并激活Caspase-3诱导细胞凋亡.
-
MMS2和P53基因对结肠癌细胞增殖与凋亡的影响
目的：探讨MMS2 siRNA与P53 siRNA对人高分化结肠癌细胞（ THC-8307）的增殖与凋亡的相互调控作用。方法：以实时定量聚合酶链反应（ qRT-PCR）、蛋白印迹法（ Western blot ）分析检测细胞转染效率，选择沉默效率具有统计学意义的THC-8307细胞作为实验组，同时将未作处理的THC-8307作为空白对照，转染空质粒细胞作为阴性对照。采用qRT-PCR及Western blot分别检测干扰各组目的基因后其两基因相互关系及表达量。采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率，以明确其对结肠癌细胞增殖与凋亡的作用。结果：实验组与对照组相比，分别沉默MMS2基因与P53基因的结肠癌细胞内P53与MMS2的mRNA与蛋白水平显著升高（ P＜0.05）。沉默MMS2实验组其早期凋亡与晚期凋亡率增加（ P＜0.05）。结论：MMS2和P53在结肠癌细胞增殖与凋亡方面起反向调控作用。
-
SIRT1表达与结肠癌细胞多药耐药性的关系
目的 建立结肠癌耐药细胞系,初步研究SIRT1表达与结肠癌细胞多耐药性的关系.方法 建立耐药细胞系HCT-8/VCR.MTT法测其交叉耐药性.RT-PCR法和免疫细胞化学法分别检测SIRT1基因的mRNA水平和蛋白水平的表达,初步探讨其与肿瘤细胞多药耐药的关系.结果 建立对长春新碱高度耐药的结肠癌细胞系,RT-PCR法和免疫细胞化学法表明SIRT1在HCT-8/VCR的表达增强.结论 SIRT1基因的表达与HCT-8/VCR的耐药性有一定的关系,耐药细胞SIRT1的表达明显比亲本细胞中的高.
-
携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达
目的 利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其在人结肠癌SW480细胞中的表达.方法 扩增目的基因VP3 cDNA,与EcoRⅤ酶切线性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭质粒连接构建重组穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP,PmeⅠ酶切线性化pShuttle-VP3-hrGFP并转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,并经PCR、EcoRⅤ、PacⅠ酶切电泳及测序鉴定,线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹转染AD293细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达,观察其感染效率及VP3蛋白表达水平.结果 pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建鉴定成功,PCR反应扩增出402 bp的片段;pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,重组腺病毒质粒经测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒pAd中,且其序列与GenBank中VP3 CDNA序列完全一致.成功包装出携带VP3基因的重组腺病毒,滴度为1.738×1012 opu/ml,重组腺病毒可在SW480细胞内得到有效表达.结论 用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并可在人结肠癌细胞中高效表达.
-
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子溶瘤2型单纯疱疹病毒注射液(Vero细胞)的药效学分析
目的 分析重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)溶瘤2型单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)的体内、外药效.方法 按不同感染复数(MOI)=0.002、0.01、0.05、0.25、1.25分别感染人结肠癌细胞(LoVo)和人喉癌细胞(Hep2),MTT法检测OH2在体外的溶瘤作用.经BALB/c-nu正常小鼠右侧肋腹皮下分别注射LoVo细胞和Hep2细胞,当肿瘤平均体积＞100 mm3时,试验组于肿瘤内分别注射高、中、低剂量的OH2(1×107、1×106、1×105 CCID50/mL),同时设阳性对照组(5 mg/mL的5-FU)及阴性对照组(DMEM/F12培养基),于第0、3和6天进行注射.首次注射后第0、3、6、9、12、15、18天测量肿瘤长径(a)和宽径(b),计算肿瘤体积(tumor volume,TV)及相对肿瘤增殖率.结果 OH2在较小浓度下(MOI分别为0.168和0.063)即可较好地杀伤LoVo和Hep2细胞.与阴性对照组比较,两种肿瘤模型的OH2高、中、低剂量组及阳性对照组均有显著抑瘤效果(P＜0.05);LoVo肿瘤模型中,OH2高剂量组的抑瘤效果明显优于中、低剂量组(P＜0.05);Hep2肿瘤模型中,OH2高、中、低剂量组的抑瘤效果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 OH2在体外和体内实验中均显示较好的溶瘤作用,具有新生物药开发前景,为临床前研究提供了实验依据.
-
大黄素对人结肠癌HT-29细胞体外增殖的抑制作用
目的 观察大黄素对人结肠癌细胞株HT-29体外增殖的抑制作用.方法 取对数生长期的HT-29细胞,按每孔5×103个细胞接种于96孔板,贴壁24h后换液,分为对照组和实验组(分别含有12.5 μM、25μM、50μM、100μM大黄素),共5组.每组均设6个复孔,于37℃、5％ CO2孵箱中分别培养24 h、48 h和72 h.采用MTT比色法检测细胞活力；倒置显微镜显像观察细胞数量变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布；分光光度法检测Caspase-3酶蛋白活性.结果 ①MTT比色法显示,处理24 h时,与对照组比较,大黄素50μM、100μM组细胞抑制率差异有统计学意义(P＜0.05),而大黄素12.5 μM、25 μM组抑制率差异无统计学意义(P ＞0.05).与对照组比较,处理48 h及72 h后大黄素12.5 μM、25μM、50μM、100 μM组的细胞抑制率差异有统计学意义(P＜0.05)；大黄素各浓度组处理48 h及72 h后的抑制率与同浓度组处理24 h比较,抑制率升高,差异有统计学意义(P＜0.05)；大黄素各浓度组处理72 h后的抑制率与同浓度组处理48 h比较抑制率升高,差异有统计学意义(P＜0.05).②倒置显微镜观测显示,对照组多为类圆形成团生长,经各浓度大黄素处理后,细胞体积缩小、间隙变大,细胞数减少.③流式细胞仪检测显示,对照组G2/M期细胞比率明显高于大黄素各浓度组,差异有统计学意义(P＜0.05)；对照组G0/G1期细胞比率明显高于大黄素25μM、50μM、100 μM浓度组,差异有统计学意义(P＜0.05)；对照组与12.5 μM大黄素组G0/G1期细胞比率差异无统计学意义(P＞0.05)；对照组S期细胞比率明显低于大黄素各浓度组,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,大黄素12.5 μM、25μM、50μM、100 μM组HT-29细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P＜0.05).④与对照组比较,大黄素各浓度组Caspase-3酶蛋白活性显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 大黄素抑制人结肠癌细胞株HT-29体外增殖,其作用呈浓度、时间依赖性；大黄素能够阻滞HT-29细胞周期,并激活Caspase-3诱导细胞凋亡.
-
受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)调控人结肠癌HT-29细胞程序性坏死的分子机制
目的 研究受体相互作用蛋白激酶1 (receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)在人结肠HT-29细胞程序性坏死过程中的作用,并探讨E3泛素连接酶三重结构域包含蛋白16 (tripartite domain containingprotein 16,Trim16)对其作用的潜在调控机制.方法 用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)建立HT-29细胞的程序性坏死模型,采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测其对凋亡、坏死细胞数目的影响.分别用Western blot和qRT-PCR检测RIPK1在细胞程序性坏死中的表达.构建稳定表达Flag标记的RIPK1的HT-29细胞株,采用Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现与RIPK1有相互作用的新蛋白.应用Ni-NTA pulldown试验检测筛选出的E3泛素连接酶对RIPK1泛素化的调控.结果 TNFα能够成功诱导HT-29细胞程序性坏死.HT-29细胞在TNFα和半胱天蛋白酶抑制剂z-VAD处理后,表现出RIPK1、RIPK3、混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)表达水平显著增加,并伴随着炎性因子白介素1α(IL1α)和白介素6(IL6)水平明显升高.Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现一个与RIPK1有相互作用的E3泛素连接酶Trim16,体外实验表明Trim16可以增强RIPK1的泛素化程度,其可能调节RIPK1在程序性坏死过程中的作用.结论 RIPK1在TNFα和z-VAD诱导人结肠癌HT-29细胞的程序性坏死过程中起重要作用,E3泛素连接酶Trim16对此过程可能有重要调控作用.
