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RNAi下调FAK基因对大肠癌细胞SW620侵袭及转移能力的影响
目的：观察应用RNAi技术下调局部粘着斑激酶(FAK)基因表达对SW620细胞侵袭及转移能力的影响。方法利用前期构建的针对FAK基因有效的短发夹RNA (shRNA )序列的慢病毒表达载体，包装慢病毒并感染人结肠癌细胞SW620。运用免疫印记(Western-blot)从蛋白水平检测FAK基因的表达， Transwell小室模型分别检测敲减FAK基因表达对SW620细胞的侵袭及转移能力的影响。结果用慢病毒敲减FAK后的大肠癌细胞，蛋白水平FAK表达明显下调， SW60细胞的侵袭及转移能力均受到明显抑制。结论下调FAK的表达水平，能明显抑制大肠癌SW620细胞的侵袭及转移能力。
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低强度脉冲超声对兔膝骨性关节炎软骨细胞整合素-局部粘着斑激酶-促分裂原活化蛋白激酶力化学转导通路相关蛋白表达的影响
目的 观察低强度脉冲超声(LIPUS)对兔膝骨性关节炎(OA)软骨细胞中整合素-局部粘着斑激酶(FAK)-促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)力化学信号转导通路相关蛋白表达的影响.方法 共选取18只新西兰大白兔,其中12只进行膝OA造模,其余6只作为正常对照.于制模后第4周处死实验兔,提取软骨细胞进行体外培养并鉴定.将所培养细胞分为正常对照组、OA模型组及OA超声组.待细胞传至第2代时,正常对照组及OA模型组细胞不给予任何处理,OA超声组细胞则给予LIPUS辐射.于LIPUS持续作用1周后收集各组细胞,应用Western blot技术检测各组细胞中Ⅱ型胶原、蛋白多糖、基质金属蛋白酶(MMPs)-13、整合素β1、FAK、MAPK(如p38、ERK1/2、JNK)蛋白表达以及磷酸化蛋白表达情况.结果 ①OA模型组及OA超声组Ⅱ型胶原、蛋白多糖含量均较正常对照组明显降低(P＜0.05),并以OA模型组下降幅度较显著,与OA超声组间差异具有统计学意义(P＜0.05).②OA模型组及OA超声组MMP-13含量均较正常对照组明显增高(P＜0.05),并以OA模型组增高幅度较显著,与OA超声组间差异具有统计学意义(P＜0.05).③OA模型组及OA超声组整合素β1、磷酸化FAK含量均较正常对照组明显增高,且以OA超声组增高幅度较显著,与OA模型组间差异具有统计学意义(P＜0.05).④OA模型组磷酸化p38、ERK1/2及JNK含量均较正常对照组明显增加(P＜0.05),OA超声组上述指标则较OA模型组显著降低(P＜0.05).结论 LIPUS体外辐射可抑制OA软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖降解及MMP-13表达,同时还能促进整合素β1表达以及FAK磷酸化,抑制p38、ERK1/2、JNK磷酸化,提示LIPUS辐射可能通过启动整合素-FAK-MAPK力学信号转导通路诱导软骨细胞外基质发生改变.
关键词： 低强度脉冲超声 软骨细胞 整合素 局部粘着斑激酶 促分裂原活化蛋白激酶 -
反义局部粘着斑激酶脱氧寡核苷酸对肝癌细胞侵袭性生长的抑制作用
目的观察反义局部粘着斑激酶脱氧寡核苷酸(FAK ODN)转染对肝癌细胞侵袭性生长的影响,并探讨其作用机制.方法以LipofecTAMINE介导的反义FAK ODN转染Bel 7402肝癌细胞株,测定Bel 7402肝癌细胞株体外生长曲线、细胞活力,测定不同时间点该细胞体外黏附能力变化,以Transwell小室测定细胞的体外侵袭能力,同时行F A K表达与细胞D N A含量的双参数流式细胞仪检测及细胞凋亡的流式细胞仪检测.结果p1 25FAK表达在反义转染组(6.49%±0.10%)显著低于正义转染组(14.33%±1.88%)与对照组(16.68%±1.62%),F=7.66,P＜0.01;反义FAK ODN转染显著抑制Bel 7402肝癌细胞株的生长,其细胞活力显著下降,肿瘤细胞抑制率在3 0%～6 0%之间;细胞体外黏附能力受到显著抑制,黏附抑制率在2 5%～5 5%间;细胞的体外侵袭能力显著下降,侵袭抑制率在1 5%～2 5%之间;细胞凋亡显著增加;细胞周期分析显示S期细胞比率显著降低,细胞生长主要阻滞在G 2/M期.结论FAK在Bel 7402肝癌细胞的黏附与迁移运动中发挥重要作用,其表达阻断显著抑制肝癌细胞的体外黏附与侵袭活性.F A K表达阻断显著抑制肝癌细胞的体外增殖,促进细胞凋亡.
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人肺腺癌SPC-A1荷瘤裸鼠中RNAi靶向沉默FAK的作用
目的:通过用脂质体包裹靶向局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)质粒(shRNA-FAK),探讨该方法对荷瘤裸鼠中人肺腺癌SPC-A1的抑制效果.方法:用脂质体包裹shRNA-FAK,并通过尾静脉注射治疗荷瘤裸鼠,通过肿瘤生长曲线和重量,肿瘤组织形态学,肿瘤中的FAK蛋白表达情况、CD31、VEGF、PCNA和TUNEL检测,分析该方法对荷瘤裸鼠中人肺腺癌SPC-A1的抑制效果.结果:荷瘤裸鼠经过脂质体shRNA-FAK治疗后,肿瘤生长速度明显缓于对照组(P＜0.05),肿瘤重量明显低于对照组(P＜0.05).肿瘤组织的免疫组化、western blot和TUNEL检测显示与对照组相比,治疗组FAK蛋白表达降低(P＜0.05)、血管生成和细胞增殖均减少(P＜0.05)、凋亡细胞增加(P＜0.05),荷瘤裸鼠主要脏器形态学正常.结论:FAK特异性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能够在体内阻断FAK蛋白的表达,使组织内FAK蛋白的表达相应地减少,并进一步诱导肿瘤细胞的凋亡,终导致肿瘤的生长速度减缓.
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靶向FAK基因RNAi联合吉西他滨抗非小细胞肺癌的作用
目的 探讨通过RNAi下调非小细胞肺癌局部粘着斑激酶(FAK)的活性后对吉西他滨药理的影响.方法 靶向FAK的shRNA重组质粒转染并下调细胞FAK蛋白表达,用Western Blot检测转染细胞中FAK的下调;利用MTT检测吉西他滨在不同浓度下对转染细胞增殖的影响;用流式细胞术、PI荧光染色检测吉西他滨作用下转染细胞的凋亡;Caspase与Akt活性分别用Apo - ONETM均质Caspase - 3/7检测系统、Western blot检测.结果 在吉西他滨不参与的情况下,FAK RNAi不能影响细胞的增殖和凋亡,但FAK RNAi明显增加了吉西他滨对肿瘤细胞的灵敏度,Akt活性的下调与这一现象有关.结论 靶向FAK的shRNA重组质粒下调细胞FAK蛋白表达能够增加吉西他滨对非小细胞肺癌的细胞毒性.
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新型靶向FAK基因shRNA的阳离子PCEC纳米材料制剂对人乳腺癌增殖和凋亡的影响
目的 制备PCEC阳离子纳米粒并复合靶向FAK的shRNA的重组质粒,观察其感染人乳腺癌435S细胞所引起的FAK下调对体外肿瘤细胞凋亡的影响.方法 用乳液溶剂扩散法制备PCEC阳离子纳米粒;将PCEC阳离子纳米粒与靶向FAK的shRNA的重组质粒静电复合并感染人乳腺癌435S细胞;用Western-bolt检测感染细胞中FAK的下调;通过MTY、PI荧光染色及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况.结果 乳液溶剂扩散法制备出100～200 Bin的PCEC阳离子纳米粒;选取100 nm的纳米粒以40:1的质量比与靶向FAK的shRNA的重组质粒复合,感染人乳腺癌435S细胞后,经Westernblot测得FAK蛋白水平明显下调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,经PI染色后细胞、细胞核出现明显的凋亡形态学变化,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带(DNA ladder).结论 PCEC阳离子纳米粒复合靶向FAK的shRNA的重组质粒具有抑制435S细胞增殖和诱导凋亡的作用.
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剪切应力对晚期内皮祖细胞细胞骨架蛋白表达及分布的影响
目的 探讨剪切应力对晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)细胞骨架蛋白局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、踝蛋白(talin)和桩蛋白(paxillin)表达及分布的影响.方法 梯度密度离心法获取大鼠骨髓单核细胞,体外培养EPCs并鉴定.以第三代即晚期EPCs作为靶细胞,给予12 dyne/cm2的剪切应力干预3h,以静止组作为空白对照.分别采用Western Blot和细胞免疫荧光观察3种细胞骨架蛋白FAK、talin和paxillin表达量和分布情况.结果 与静止组相比,剪切应力作用EPCs 3 h后:FAK蛋白的表达量显著增加,变化为静止组的2.06±0.01倍,差异有统计学意义(P＜0.01),表达位置沿剪切应力方向聚集成束并延伸至细胞边缘;而talin和paxillin蛋白的表达量则均有所下降(P＜0.01).结论 剪切应力能影响晚期EPCs上细胞骨架蛋白FAK、talin和paxillin的表达及分布.
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肺癌组织中MRP-1和FAK蛋白的表达及其临床意义的探讨
背景与目的: 肿瘤细胞发生浸润转移的首要基础是细胞移动性增强,此过程受到极其复杂的多基因调控,移动相关蛋白 -1(Motility-related-protein-1, MRP-1)是一种能抑制细胞移动能力的蛋白,它表达的下调可能是肿瘤细胞获得浸润转移恶性表型的关键,但其调控机制仍不清楚.局部粘着斑激酶 (Focal adhesion kinase, FAK)是整合素介导的信号转导过程中的中心分子,它与细胞癌变、分化、浸润相关.但二者在肺癌中的表达情况,与临床病理学参数之间的关系及二者之间的相关性如何国内外报道尚不一致.本文拟通过分析 MRP-1和 FAK两种蛋白在肺癌组织中的表达及其与临床病理学参数之间的关系,探讨二者在肺癌发生发展、浸润转移中的作用. 材料与方法: 采用免疫组化链霉亲和素过氧化物酶法 (Streptavidin peroxidase, SP)检测 10例正常肺组织、 89例肺癌组织和 12例淋巴结转移肺癌组织中 MRP-1和 FAK蛋白的表达. 结果: MRP-1在正常肺组织中阳性表达率为 100.0%,在肺癌组织中为 41.6%,而在转移癌组织中仅为 8.3%,显著下调; FAK蛋白在正常肺组织中仅微弱表达,阳性率为 10.0%,在肺癌组织中阳性表达率为 48.3%,而在转移癌组织中为 83.3%,过度表达, 3组之间差异有统计学意义. MRP-1和 FAK蛋白呈显著负相关.在肺原发癌组织中 MRP-1的表达与患者年龄、性别、肿瘤大体类型均无关,而与肿瘤的组织类型、分化程度、临床分期、以及是否伴有淋巴结转移密切相关; FAK的表达与患者年龄、性别、肿瘤大体类型及组织学类型均无关,而与肿瘤的分化程度、临床分期、以及是否伴有淋巴结转移密切相关. 结论: MRP-1、 FAK的异常表达可能参与了肺癌的浸润转移,检测这两项指标对预测肺癌的进展有一定的参考价值.
