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丹参多酚酸盐修复糖基化终产物引起的晚期EPCs功能障碍及其分子机制
目的 观察丹参多酚酸盐对糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)引起的晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能障碍的修复作用,并探讨其中分子机制.方法 密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,采用EGM-2-MV培养液培养晚期EPCs;利用牛血清白蛋白及葡萄糖制备晚期糖基化修饰的白蛋白(AGE modified bovine serum albumin,AGE-albumin).实验分为单独加入200 μg/mLAGE-albumin的AGE组;同时加入200 μg/mL AGE-albumin及0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL的丹参多酚酸盐低、中、高剂量组;加入200μg/mL未经修饰白蛋白的对照组.采用Annexin V/PI双染法检测晚期EPCs凋亡;ECMatirx-gel检测晚期EPCs形成新生血管的能力.采用RT-PCR法检测细胞中糖基化终产物受体(the receptor for AGE,RAGE)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA水平;Western blot法检测RAGE、eNOS及蛋白激酶Akt的蛋白表达水平.结果 与对照组比较,AGE组AnnexinV+/PI-细胞比例增加,在ECMatirx-gel上形成新生血管能力降低;晚期EPCs中rage mRNA及RAGE蛋白表达增加,enos mRNA及eNOS及Akt蛋白表达减少.丹参多酚酸盐1.0、10.0 μg/mL组,与AGE组比较,晚期EPCs凋亡明显减少(P<0.05,P<0.01),在ECMatirx-gel上形成新生血管能力增加(P<0.01),晚期EPCs中RAGE表达减少(P<0.05,P<0.01),eNOS、Akt表达增加(P<0.05);与对照组比较,丹参多酚酸盐10μg/mL组对晚期EPCs凋亡及在ECMatirx-gel上形成新生血管能力,rage mRNA及RAGE,enos mRNA及eNOS,Akt蛋白表达,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 AGE使EPCs功能受损,表现为凋亡增加、迁移及体外形成新生血管的能力下降,丹参多酚酸盐可修复由AGE-albumin引起的EPCs功能损害.
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骨形态发生蛋白4/DNA结合抑制剂2信号通路在晚期内皮祖细胞修复血管内皮损伤中的作用
目的 研究骨形态发生蛋白4 (BMP4)信号通路在晚期内皮祖细胞(LEPC)介导的血管内皮修复中的作用与分子机制.方法 分离健康人外周血单核细胞体外培养7d和28 d分别得到早期内皮祖细胞(EEPC)和LEPC,观察BMP4在EEPC和LEPC中的表达情况.体外采用短发卡RNA(shRNA)沉默技术和基因转染干预BMP4的表达,观察其下游分子靶点DNA结合抑制剂2(Id2)表达情况及对LEPC的迁移、黏附等功能的影响.建立裸鼠颈动脉内膜拉脱损伤模型,在体观察干预BMP4信号通路如何介导LEPC修复血管内皮损伤.结果 相对于EEPC,BMP4选择性高表达于LEPC(P＜0.01).shRNA法沉默LEPC的BMP4表达后,其下游靶点Id2的表达水平下调(P＜0.01);相应的LEPC体外迁移、黏附能力明显减低(P＜0.01);将沉默了BMP4的LEPC在体移植到裸鼠后其颈动脉内皮损伤的修复面积明显减小[(34±6)％比(58±7)％,P＜0,01].基因转染上调LEPC的BMP4表达后,其下游的Id2表达明显增强(P＜0.01),LEPC的迁移、黏附功能改善(P＜0.01),移植到裸鼠体内后其颈动脉内皮损伤的修复面积明显增加[(75±5)％比(59±6)％,P＜0.01].结论 LEPC修复血管内皮损伤的作用与BMP4/Id2信号通路的表达密切相关.
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晚期内皮祖细胞对共培养心肌细胞功能的影响
目的:研究晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)和心肌细胞(cardiomyocyte,CM)在非接触条件下共培养对CM细胞增殖、凋亡功能的影响,并分析其相关机制.方法:采用密度梯度法从大鼠骨髓获取单个核细胞,培养28 d,FITC-UEA-I、Dil-acLDL和DAPI三染色鉴定为晚期EPCs.分别吸取晚期EPCs和乳大鼠CM,按0∶1,1∶1,5∶1,10∶1的细胞比率分别植于Transwell小室,下室植入晚期EPCs,上室植入CM.将晚期EPCs与CM非接触共培养12 ～ 48 h,分别采用MTT比色法、Tunel法检测其增殖、凋亡功能.并于晚期EPCs与CM共培养48 h后,应用ELISA试剂盒检测不同比率组(0∶1 ～10∶1)上清液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度.结果:体外培养7d时,EPCs细胞呈典型长梭形；28 d时,呈铺路石样,并可摄取FITC -UEA-I、Dil-acLDL.晚期EPCs可促进共培养的CM增殖,减少凋亡.随着晚期EPCs与CM细胞比率的增加,不同共培养时间组的CM增殖功能均明显增强(P＜0.05),凋亡功能均明显降低(P＜0.05)；且随共培养时间延长,不同比率组的CM增殖功能亦均明显增强(P＜0.05),凋亡功能均明显降低(P＜0.05)；当晚期EPCs与CM比率为10∶1、共培养48 h时,CM增殖功能强(P=0.00),凋亡低(P=0.00).当晚期EPCs与CM共培养48 h后,随晚期EPCs/CM数量比率的增加上清液中VEGF浓度明显增加(P＜0.05).结论:在非接触共培养条件下,随着晚期EPCs与CM比率的增加以及共培养时间的延长,CM增殖明显增强、凋亡明显降低；可能与晚期EPCs通过分泌VEGF从而改善CM增殖、凋亡功能有关.
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瑞舒伐他汀对晚期内皮祖细胞增生、迁移及凋亡的影响
目的 观察不同浓度及不同时间的瑞舒伐他汀(rosuvastatin)对晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增生(proliferation)、迁移(migration)和凋亡(apoptosis)的影响.方法 采用密度梯度法从大鼠骨髓获取单个核细胞,培养28 d,通过FITC-UEA-I和DiI-acLDL双染色鉴定为正分化晚期EPCs.以不同浓度的瑞舒伐他汀(0.001、0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L)和晚期EPCs共培养24 h,分别采用MTT比色法、Transwell小室及Tunel法检测其增生、迁移及凋亡功能;以浓度为0.1 μmol/L的瑞舒伐他汀与晚期EPCs分别共培养1、3、6、12、24、48 h,应用同样方法检测其增生、迁移及凋亡功能.结果 体外培养7 d时,细胞呈典型长梭形;28 d时,呈铺路石样,并可摄取FITC-UEA-I和DiI-acLDL.不同浓度的瑞舒伐他汀组与对照组相比均可明显地改善晚期EPCs的增生(P<0.05)、迁移(P<0.05)及凋亡(P<0.05)功能,且浓度为0.1 μmol/L的瑞舒伐他汀改善细胞功能强(P<0.05).当瑞舒伐他汀浓度为0.1 μmol/L、共培养不同时间后,与对照组相比可增强晚期EPCs的增生(P<0.05)、迁移(P<0.05)及抗凋亡(P<0.05)功能.结论 瑞舒伐他汀能够提高晚期内皮祖细胞的增生、迁移功能,减少细胞的凋亡,且呈浓度及时间依赖性.
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微环境在体外大量扩增晚期内皮祖细胞中的作用
目的 探讨做为微环境的滋养层细胞在体外大量扩增晚期内皮祖细胞(EPC)中的作用.方法 预铺辐射后的滋养层细胞,而后植入分离的外周血单个核细胞,计数培养21 d后获得的晚期EPC克隆数目,并检测目的细胞免疫表型,用Matrigel鉴定其体外血管形成能力.采用动态显微镜追踪单个干细胞在滋养层细胞上的分化过程.结果 培养21 d时,在预铺晚期EPC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为滋养层的培养环境下,每100ml外周血单个核细胞分别获得(40.0±3.9)和(39.3±3.1)个晚期EPC克隆,均明显高于无滋养层条件下的(2.0±1.3)个(P均＜0.05).目的细胞可表达CD31、CD34、eNOS、FLt-1、P1H12、Sendo、VEcadherin和CD117,并在体外与Matrigel形成管状结构.动态追踪示单个于细胞的扩增是在有滋养层细胞参与下完成不对称分裂的.结论 通过提供滋养层细胞方法可以大量扩增晚期EPC,滋养层细胞可能参与了早阶段内皮干细胞的不对称分裂扩增.
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晚期内皮祖细胞大量扩增方法
目的 通过实验验证一个体外大量扩增晚期内皮祖细胞( EPC)的方法.方法 先预铺经辐射后的滋养层细胞(晚期EPC或脐带脐静脉内皮细胞),而后植入分离的人外周血单个核细胞,计数并对比培养21 d后获得的晚期EPC克隆数目,并检测目的细胞免疫表型,应用基质胶( matrigel)鉴定其体外管状结构形成能力.结果 21 d时在预铺的两种滋养层细胞培养条件下获得的晚期EPC克隆数目均比无滋养层细胞的培养方法高20倍(40.0±3.9、39.3 ±3.1比2.0±1.3,均P＜0.05)；且细胞克隆出现的早.目的细胞表达CD31、CD34、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮细胞生长因子受体Flt-1、CD146的2个表型(P1H12、Sendo)、血管内皮钙黏蛋白(VEcadherin)、CD117,且具有能在体外与matrigel形成管状结构的功能.结论 通过提供滋养层细胞的方法可以大量扩增晚期EPC,提示微环境在晚期EPC扩增中起重要作用.
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sEHi对颈动脉狭窄患者晚期内皮祖细胞功能的影响
目的 研究不同浓度可溶性环氧化物水解酶抑制剂(soluble epoxide hydrolase inhibitor,sEHi) AUDA 对颈动脉狭窄(carotid stenosis,CS)患者外周血来源的晚期内皮祖细胞(late endothelial progenitor cell,late EPC)的影响.方法 入选研究对象60例,分成颈动脉狭窄组(n=35)和对照组(n=25).密度梯度离心法,从外周血获取单个核细胞培养至21 d后鉴定内皮祖细胞;以不同浓度AUDA(0,0.1,1,10 μmol/L)和晚期EPC共培养24h,分别采用MTT法,黏附能力测定实验和Transwell小室来观察其增殖,黏附,迁移能力.同时采用Western blot法观察AUDA处理后其VEGF的表达.结果 体外培养21 d时,细胞呈典型长梭形,21 d时,呈铺路石样,并可摄取FITC UEA-I和Dil-acLDL.与对照组相比,CS患者late EPC的增殖,黏附和迁移能力均显著下降(P＜0.05);与处理前(0umol/L)相比,AUDA呈剂量依赖性地增强CS患者late EPC增殖,黏附和迁移能力并促进CS患者late EPC表达VEGF.结论 sEHi具有促进late EPC增殖,黏附和迁移等功能的作用,其有望成为一类治疗CS的新型药物.
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晚期内皮祖细胞在纳米聚-L-乳酸支架膜表面的粘附和增殖
目的 通过比较晚期内皮祖细胞在纳米无序及有序聚-L-乳酸支架膜表面粘附、增殖情况,为优化组织工程材料提供一种新途径.方法 通过静电纺丝技术制备纳米聚-L-乳酸纤维支架,行低温等离子体技术改性及Ⅰ型胶原表面涂覆,与晚期内皮祖细胞复合培养,并进行细胞双荧光染色鉴定,通过不同时间点两组材料晚期内皮祖细胞粘附和增殖率的测定比较及光镜、荧光显微镜和扫描电镜观察支架材料对种子细胞形态特征等方面的影响.结果 制得的纳米聚-L-乳酸纤维孔径在300～400 nm之间,孔隙率>90%;细胞粘附12 h基本完成;各时间点有序膜组增殖率明显高于无序膜组(P<0.05).细胞在支架膜上生长良好,无序膜组细胞生长较散在、杂乱;有良好空间定向效果的有序纤维支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,分泌胞外基质.结论 晚期内皮祖细胞是理想的组织工程种子细胞来源;纳米聚-L-乳酸有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的粘附、增殖,并能较好地保持细胞形态.是一种理想的血管组织工程支架材料.
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外周血两种不同类型内皮祖细胞与颈动脉狭窄的关系
目的 探讨外周血中早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞数量和功能变化与颈动脉狭窄程度之间的关系.方法 入组对象60例,根据全脑血管造影术分成颈动脉狭窄组40例(其中轻度狭窄组20例,中重度狭窄组20例),对照组20例.在全脑血管造影术中抽取患者股动脉血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,分别培养至7天和21天鉴定为早期内皮祖细胞、晚期内皮祖细胞,计数细胞集落数量并分别用MTr比色法、改良的Boyden小室法和HFN培养板测定早期内皮祖细胞、晚期内皮祖细胞的增值、迁移、黏附功能.结果 颈动脉狭窄组患者吸烟、高血压、甘油三酯、低密度脂蛋白明显高于对照组,高密度脂蛋白低于对照组(P＜0.05)；而年龄、性别、血糖、总胆固醇与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,颈动脉狭窄组外周血早期内皮祖细胞、晚期内皮祖细胞数量及功能均下降(P＜0.05),晚期内皮祖细胞数量与功能改变与颈动脉狭窄程度呈负相关(P＜0.05).结论 颈动脉狭窄患者外周血晚期内皮祖细胞数量减少,功能受损,其数量与功能变化与颈动脉狭窄程度呈负相关.对于颈动脉狭窄患者,检测晚期内皮祖细胞数量及功能可间接预测颈动脉狭窄严重程度.
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纳米多孔PLLA膜对晚期内皮祖细胞行为的影响
目的 观察晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在纳米多孔PLLA膜表面黏附、增殖的情况,为优化组织工程血管支架材料提供一种新途径. 方法 新西兰大白兔,体重2.5～3.0 kg,雌雄不限.取兔外周血分离和培养晚期EPCs.采用静电纺丝技术制备纳米无序纤维、有序纤维及超级有序纤维,行低温等离子体技术改性及Ⅰ型胶原表面涂覆,制备无序膜、有序膜及超级有序膜.实验分为A(单纯细胞)、B(无序膜)、C(普通膜)、D(有序膜)、E(超级有序膜)组,将原代晚期EPCs(1 × 105个/mL)复合至支架材料培养,3、5、7、9、11、13、15和17 d后MTT法检测细胞增殖能力;实验分A(无序膜)、B(普通膜)、C(有序膜)、D(超级有序膜)4组,取浓度为1× 105个/mL的第3代晚期EPCs悬液3 mL滴加至膜上,复合培养4、12和24 h后沉淀法检测细胞黏附率,1、3、7 d测定细胞增殖率,并于复合培养后4、24、72 h观察细胞形态变化. 结果 纳米PLLA纤维直径300～400 mm,孔隙率>90%.培养后3、5、7、9、11、13、15和17 d,各组A值均随培养时间延长而增高,细胞生长良好;A、B组间各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05),培养后5～17 d,C、D、E组与A、B组间比较差异均有统计学意义(P<0.05).复合培养4h,A组黏附率高于B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05);12 h及24 h,B、C、D组黏附率明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05);各组4h与12、24h比较差异均有统计学意义(P<0.05),12h与24h比较差异无统计学意义(P>0.05).复合培养1、3和7d,B、C、D组增殖率明显高于A组,差异有统计学意义(P<0.05);B、C、D组间除培养后1 d,其余各时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05).形态学观察示细胞在各支架膜上生长良好,A组及B组细胞生长较散在、杂乱;C、D组细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖并分泌ECM,D组细胞结构保持更好. 结论 纳米多孔PLLA有序膜及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面黏附、增殖,并能较好保持细胞形态,是一种理想的血管组织工程支架材料:晚期EPCs是一种理想的血管组织工程种子细胞.
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剪切应力对晚期内皮祖细胞细胞骨架蛋白表达及分布的影响
目的 探讨剪切应力对晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)细胞骨架蛋白局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、踝蛋白(talin)和桩蛋白(paxillin)表达及分布的影响.方法 梯度密度离心法获取大鼠骨髓单核细胞,体外培养EPCs并鉴定.以第三代即晚期EPCs作为靶细胞,给予12 dyne/cm2的剪切应力干预3h,以静止组作为空白对照.分别采用Western Blot和细胞免疫荧光观察3种细胞骨架蛋白FAK、talin和paxillin表达量和分布情况.结果 与静止组相比,剪切应力作用EPCs 3 h后:FAK蛋白的表达量显著增加,变化为静止组的2.06±0.01倍,差异有统计学意义(P＜0.01),表达位置沿剪切应力方向聚集成束并延伸至细胞边缘;而talin和paxillin蛋白的表达量则均有所下降(P＜0.01).结论 剪切应力能影响晚期EPCs上细胞骨架蛋白FAK、talin和paxillin的表达及分布.
