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蛛丝蛋白复合材料小直径血管支架的体内降解及体外生物相容性的研究
探讨蛛丝蛋白复合材料小直径血管支架的体内降解性能和生物相容性,为其临床应用奠定基础.通过静电纺丝仪,将RGD-重组蛛丝蛋白(pNSR16)、聚己内酯(PCL)、明胶(Gt)、壳聚糖(CS)共混形成的纺丝液进行电纺,制得(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架,并将其植入SD大鼠腿部肌肉中,通过肉眼外观观察、组织切片HE染色评价等方法,评价蛛丝蛋白复合材料小直径血管支架的体内降解情况.分析支架浸提液对间充质干细胞集落形成、细胞分裂指数、台盼蓝拒染率、细胞毒性和细胞周期的影响,评价血管支架的生物相容性.血管支架在整个植入期内不断降解,(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架降解程度更深,纤维断裂严重,12周时失重率为20.3％,其降解速度明显快于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,后者在12周时仅降解了13.2％.在(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)支架浸提液培养条件下的大鼠骨髓MSC集落生成率、平均集落面积和分裂指数都显著高于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架组.血管支架毒性等级均低于1级,无细胞毒性.与血管支架浸提液复合培养的MSC生长状态良好,台盼蓝拒染率高于95％,复合培养48 h后,细胞Go/1期比例降低,S、G2/M期比例均升高.蛛丝蛋白复合材料小直径血管支架的体内降解和生物相容性良好,应用于临床具有一定的可行性.
关键词： 组织工程血管 蛛丝蛋白复合材料小直径血管支架 体内降解 体外生物相容性 -
骨髓间充质干细胞复合蛛丝蛋白血管支架构建小直径组织工程血管的研究
应用动态培养的方式,将骨髓间充质干细胞和蛛丝蛋白血管支架复合培养构建小直径组织工程血管,为心血管疾病修复提供新的血管移植物来源.将间充质干细胞种植到管状的血管支架内腔,应用动态培养的方法构建小直径组织工程血管,并根据扫描电子显微镜观察、HE染色、缝合强度测试、DNA含量检测、羟脯氨酸测定等指标评价组织工程血管的形成程度.复合培养7d后,细胞在纳米纤维支架表面充分铺展,并且可以迁移到纤维内部生长,细胞与血管支架表现出较好的相容性.组织工程血管的缝合强度经测试为(0.95±0.12) N/针,是天然血管的29.6％.随着时间的持续,组织工程血管中的羟脯氨酸含量和DNA含量不断增加,羟脯氨酸含量在第14和第28 d分别达到0.16和0.2μg/mg,且与对照组相比在统计学上有显著性差异.成功构建了一种小直径组织工程血管,各指标较为优良,为其临床应用奠定了基础.
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动物血管脱细胞方法及细胞外基质材料评价研究
采用独立设计的反复冻融方法,去除兔颈总动脉中的血管细胞,对所获得的细胞外基质进行组织、生化、力学等分析.在分离兔颈总动脉后,首先用低渗缓冲液处理,然后经低温反复冻融,后用非离子型去污剂处理.所得的支架行组织染色和扫描电镜分析,显示基质的微观结构;荧光染色和基因组DNA PCR分析,检测细胞DNA残留;分别行羟脯氨酸定量分析和轴向拉伸强度分析,检测胶原蛋白和血管生物力学性能的变化;支架没有明显的细胞毒性,溶血率低于医用材料的标准;支架随时间缓慢降解.种植兔的骨髓干细胞,研究细胞在支架上的粘附生长能力.应用本方法能彻底去除血管细胞,没有细胞碎片和DNA的残留,并保留了较完整的细胞外基质和力学性能,具有开放的大孔径结构,细胞生物相容性好,是一种理想的组织工程血管支架材料.
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间充质干细胞与组织工程血管
间充质干细胞在再生医学领域中具有重要的应用价值,其增殖能力强,免疫原性低,具有良好的分化潜能,是理想的组织工程血管种子细胞.本文系统总结了应用间充质干细胞构建组织工程血管的研究进展,介绍了间充质干细胞分离纯化和鉴定方法,分类阐述了间充质干细胞构建组织工程血管的几种方法,并探讨了其优缺点.
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脱细胞脐血管在组织工程血管中的研究进展
随着心血管疾病患病率的增加,心血管外科临床上将需要大量血管替代物.由合成材料制造的大口径人工血管(直径＞10 mm)已经应用于临床,而小口径血管(直径≤5 mm)移植入人体内易发生吻合口处内膜增生和血栓形成,中远期通畅率不佳.所以研制出1种新型的小口径人工血管已成为目前的研究热点.
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组织工程人工血管的临床应用研究进展
为了寻找理想的血管替代物,涌现很多组织工程血管构建方法 ,如动物蛋白凝胶支架细胞种植,可降解支架细胞种植,组织片层组装,胸、腹腔生物反应器管芯诱导等.有的已部分或完全满足临床应用条件或已应用于临床,本文对大动物试验和临床应用中表现性能较好的构建模型加以综述,并探讨目前研究中的问题及对未来的展望.
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异种血管组织的脱细胞研究
目前,临床上涉及小口径动脉闭塞的血管疾患呈增多的趋势,然而可供选择的移植物却并不多,虽然聚四氟乙烯等材料用于大口径动脉的移植取得了较好效果,但用于小口径动脉移植的远期通畅率却不尽如人意.作为金标准的大隐静脉或自体动脉移植又受到来源、额外手术创伤与经济负担的困扰.组织工程血管的出现有望解决这个难题.以脱细胞的异种血管作为构建组织工程血管用支架目前研究的较为广泛.本文对目前常用的各种脱细胞方法及其相关的问题做一简要综述.
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生物反应器内构建小口径组织工程血管的实验研究
近年来心脏及周围血管动脉硬化病变的患者大量增加,仅美国每年就有约140万人需要接受血管置换~([1]).目前大口径人工血管的临床应用已获得广泛的成功,而小口径人工血管却一直未获得满意的效果~([2]),主要是由于缺乏理想的内皮细胞层而易导致血栓形成,血管长期通畅率较差.自体血管因其来源、大小、长度等原因不能完全满足临床需要,因此,研制出一种拥有较高远期通畅率的小口径人工血管成为了一个重要的研究课题.本研究将骨髓间充质干细胞(MSCs)种植于ε-己内酯/L-丙交酯(PCLA)组织工程血管支架,进行生物反应器内组织工程血管构建的探索.
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以脱细胞犬动脉为基质的血管支架体外再细胞化
目的 对已成功制备的以脱细胞犬动脉为基质的血管支架进行体外再细胞化研究.方法 多聚环氧化合物家族的乙二醇缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether,EX-810)、去离子水和超声共同作用于犬主动脉,制备血管支架,并在体外对其进行有效的再细胞化,包括人脐动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)的种植,人脐静脉内皮细胞(endothelial cell,EC)的种植,以及两种细胞的复合种植.结果 本文提出的制备血管支架适合SMC和EC的生长,以合适的接种密度进行再细胞化即可获得致密的细胞层;提高细胞的种植密度可以加速支架的再细胞化进程.SMC和EC复合种植模型中,高密度接种的EC能够在不同密度的SMC上生长,形成较为致密的EC单层;但共培养的EC的形态和覆盖率受SMC接种密度的影响.结论 在脱细胞犬动脉上成功实现EC和SMC的单独种植和联合种植.
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血管组织工程生物材料细胞相容性的评价
目的探讨以聚羟基丁酸戊酸酯(PHBV)为主体的几种生物材料和人包皮成纤维细胞的生物相容性,为组织工程血管初步选择较好的支架材料.方法将以PHBV为主体的几种生物材料和人包皮成纤维细胞体外培养,并对材料的接触角、细胞的形态和细胞的增生情况进行测定.结果所有的材料中,PHBV生物材料接触角小,与细胞的相容性好.结论 PHBV具有良好的细胞相容性,从而为组织工程血管初步筛选出一种较好的生物材料.
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胶原蛋白和弹力蛋白在血管组织工程中的应用
胶原蛋白和弹力蛋白是细胞外基质的2个非常重要的组成成分,不同的细胞外基质对于内皮细胞生长和组织再生都有很重要的作用.胶原蛋白是构成细胞外基质的骨架结构,用不同的方法将胶原与不同的物质聚合可以得到不同机械性能和生物特性的血管支架.胶原蛋白作为一种促凝剂,利用一定的方法尽量避免组织血管中胶原蛋白的暴露,可以防止工程血管的血栓形成,胶原交替联接和胶原袖套混合物可以加强支架替代物的机械强度;弹力蛋白是血管的重要的结构和起重要调节作用的基质蛋白,赋予血管壁弹性和良好生物学特性,用于支架和包被支架材料方面显示出巨大的应用潜能.
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聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管
目的:探讨改良聚乙交酯-聚丙交酯(PLGA)降解支架复合胎儿脐动脉细胞方法构建组织工程血管(TEBV)的可行性.方法:将胎儿脐动脉的平滑肌细胞,内皮细胞种植于国产PLGA血管上并进行培育,观察两种细胞生长情况、检测内皮细胞、平滑肌细胞并测定其功能.结果:培育2mo后,平滑肌细胞,内皮细胞在PLGA血管片上黏附良好,材料组织相容性好.结论:应用PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的体外培养方法是可行的,PLGA支架有利于细胞生长、分化及功能发挥,动态培养方法培养出的TEBV色泽光亮,厚度均匀,具有良好的弹性.
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聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的动物实验研究
目的:为了进一步探讨PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建TEBV的可应用性,观察第一部分制备的TEBV在动物体内通畅情况以及形态学改变的结果.方法:6只小型猪随机分成2组,分别将第一部分实验A和B组制备成的TEBV置换小型猪一侧颈总动脉,成为本实验A组和B组,血管超声观察移植血管的情况,8wk后取材肉眼、光镜和电镜组织学观察.结果:术后8wk血管超声观察A组血管全部闭塞(3/3),B组血管有1根发生轻中度狭窄(1/3),余血管通畅良好;镜下发现A组血管炎性细胞密集分布,平滑肌细胞坏死;B组动脉炎性细胞浸润少,血管结构较完整,内皮细胞平整,肌层局部有溶解、部分肌细胞纤维化.结论:PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建TEBV在体内保持较高的通畅率,是解决小口径血管的新途径.
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不同细胞浓度种植于脱细胞血管基质上的细胞生长方式
背景:对于组织工程血管而言,如何在平滑肌细胞层上成功获得致密的内皮细胞层是为关键的.目的:探索不同细胞种植浓度对构建全生物化组织工程血管的影响.方法:先将不同浓度(5×105,5×107 L-1)猪血管平滑肌细胞种植在猪脱细胞血管基质上,培养3 d后再将不同浓度(5×105,5×107 L-1)内皮祖细胞接种在平滑肌细胞-血管基质复合体上,构建片状全生物化组织工程材料.结果与结论:高浓度与低浓度平滑肌细胞在脱细胞血管基质上的细胞生长曲线相似,并且种植在孔板上和在脱细胞基质上的生长曲线亦相似,但低浓度组增殖较慢,覆盖率较低.细胞覆盖率由高到低的顺序为:高浓度内皮祖细胞+含高浓度平滑肌细胞的脱细胞基质>高浓度内皮祖细胞+含低浓度平滑肌细胞的脱细胞基质>低浓度内皮祖细胞+含高浓度平滑肌细胞的脱细胞基质>低浓度内皮祖细胞+含低浓度平滑肌细胞的脱细胞基质,且高浓度内皮祖细胞在脱细胞基质上可形成较为致密的细胞层,呈现出铺路石样生长方式.说明提高细胞接种浓度有利于其在材料表面快速形成致密的细胞层.
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组织工程小口径血管的制备及性能检测
背景:由于材料来源问题、材料血液相容性和抗凝性能不佳,致使小口径组织工程血管无法应用于临床.目的:探究经过脱细胞处理后绵羊颈动脉的理化性能及力学性能,为制备组织工程血管寻找合适材料.方法:获取新鲜离体绵羊颈动脉,分2组处理,对照组进行修剪及清洗处理,冻存备用;实验组进行修剪及清洗处理后,以Triton X-100+脱氧胆酸钠盐+EDTA进行脱细胞处理24 h,漂洗72 h,接着以RNA酶/DNA酶消化24 h,漂洗24 h后冻存备用.将两组血管进行苏木精-伊红染色、胶原纤维染色、弹力纤维染色及电镜扫描观察,检测血管的抗拉力强度、血管壁张力及厚度.结果与结论:①胶原纤维染色显示,对照组胶原纤维排列整齐,致密,无明显断痕;实验组胶原纤维排列整齐,致密,无明显断痕;②苏木精-伊红染色显示,对照组细胞核分布在血管的内膜、中层、外膜,纤维走行规则;实验组纤维走行规则,较松散,内膜、中层、外膜无明显细胞核分布;③弹力纤维染色显示,对照组弹力纤维分布规则,整齐,主要在于血管的中层及外膜;实验组弹力纤维走行规则,但较疏松,主要分布在于血管中层及外膜;④电镜扫描显示,实验组血管保持原有的形态,未见细胞结构残留,胶原纤维走行规则,连续性完整,孔隙结构较均匀;⑤实验组血管厚度低于对照组(P＜0.01),两组拉力强度无差异,均可承受46.55 kPa的压力;⑥结果表明,经脱细胞处理的绵羊颈动脉,在大程度去除抗原性的基础上保留了血管必要的力学性能.
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人脐带内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养特照
目的:如何便捷有效地获取种子细胞是构建组织工程皮肤、角膜、血管等成功与否的关键,实验对人胎儿脐带内皮细胞和平滑肌细胞的分离、纯化、培养扩增技术进行探讨.方法:实验于2006-11在暨南大学医学院完成.①实验材料:剖宫产正常胎儿脐带由暨南大学第一临床学院提供,产妇均知情同意.②实验方法:配制培养液,A液为在M199培养液中加入20%胎牛血清、20 mg/L肝素、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,B液为在M199培养基中加入10%胎牛血清、250 mg/L G418.取脐带15～20 cm,采用胶原酶"灌注消化法"获取脐带内皮细胞制成悬液,静置0.5 h后利用成纤维细胞短时间内贴壁的特点,把尚未贴壁细胞吸出重新接种于含有A液的培养瓶,初步去除部分成纤维细胞,细胞贴壁24 h后将培养液换为B液,继续培养3 d,去除成纤维细胞,然后再用A液扩大培养.从消化完脐静脉内皮细胞的脐带中剥取脐动脉,刮除内皮细胞,将血管条剪成小块均匀贴于培养瓶底,培养瓶内加入含20%小牛血清的DMEM培养液2 mL,缓慢竖直培养瓶,以培养液刚未浸没培养块为佳,放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内干涸8 h后,将培养瓶轻轻翻转,使植块刚浸入培养液中,绝对静置3 d,以后每3 d换液1次,待植块周围生长晕的细胞融合成片时,即可传代,传代后DMEM培养液的血清浓度由原来的20%改为5%,且在培养液中加入0.2 L肝素.③实验评估:通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况,分别以第Ⅷ因子、α-肌动蛋白免疫组织化学染色法鉴定内皮细胞和平滑肌细胞.结果:①内皮细胞的生长观察:接种24 h后,镜下可见刚贴壁的细胞呈圆形,逐渐转变为多角形或梭形,胞间可见有成纤维细胞混杂,加入B液3 d后成纤维细胞逐渐死亡.传代细胞呈"铺路石"样,细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕,为典型的内皮细胞生长特点.②内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的检测:胞浆丰富且有棕黄色颗粒,细胞核不着色,呈阳性反应.③平滑肌细胞的生长观察:镜下组织块贴壁后5～7 d可见有少数细胞从植块边缘游出,第10～15天植块周围形成明显的细胞生长晕,细胞呈长梭形、带状或三角状,有1～4个细胞核,可见半透明颗粒,第20～25天细胞密集、平行排列,形成"峰谷样"结构,是平滑肌细胞的特征性生长表现.④平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白单克隆抗体检测:胞浆内可见棕黄色细丝,为特异性α-平滑肌肌动蛋白,细胞核不着色.结论:以胎儿脐带作为种子细胞的来源,成功分离后通过调节培养液的成分,既能排除成纤维细胞的污染又可以令内皮细胞和平滑肌细胞快速增殖.
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脱细胞支架复合兔骨髓间充质干细胞构建组织工程血管
背景:目前临床使用的小口径(<6 mm)人工血管因生物相容性差、远期通畅率低,效果并不理想.因此,学术界一直致力于寻找具有正常血管生物学功能的血管代用品,组织工程血管的构建与功能研究已成为目前热门研究课题.目的:将兔骨髓间充质干细胞与脱细-胞血管支架动态复合培养体外构建组织工程血管,通过体内移植实验,探讨该组织工程血管的组织相容性及通畅率.设计、时间及地点:随机对照实验,细胞学、组织病理学观察,于2006-01/2008-06在南京大学医学院附属鼓楼医院实验室完成.材料:通过去污剂-酶消化法制备兔腹主动脉脱细胞支架;采用密度梯度离心法结合贴壁分离培养法,分离扩增兔骨髓间充质干细胞,将扩增后的干细胞静态种植于脱细胞支架后置于生物反应器中动态培养构建组织工程血管.方法:60只兔随机均分为3组,剪取一段腹主动脉长约1.0 cm,再将移植血管以8/0聚丙烯线间断外翻吻合到腹主动脉上.组织工程血管组:受体为对应抽取骨髓干细胞的实验兔,以组织工程血管为移植血管;脱细胞血管支架组:以脱细胞处理的同种异体腹主动脉为移植血管;同种异体血管组:以同种异体新鲜腹主动脉作为移植血管.主要观察指标:对培养的骨髓间充质干细胞进行免疫组化鉴定;血管移植后3个月行数字减影血管造影、病理切片、扫描电镜等观察移植效果.结果:兔骨髓间充质干细胞在体外培养8 d后形成漩涡状排列,免疫组化结果符合间充质干细胞表型特征:将间充质干细胞与脱细胞支架置于生物反应器培养12 d后,种子细胞在血管腔内黏附生长;血管移植3个月后,组织工程血管组、脱细胞血管支架组通畅率分别为90%,80%,均优于同种异体血管组(25%).移植3个月后苏木精一伊红染色及扫描电镜结果显示,组织工程血管组形成清晰的内、中、外膜3层结构,形态接近正常动脉,内皮细胞覆盖完整;脱细胞血管支架组血管内表面内皮细胞覆盖不完整,伴有附擘血栓形成,内膜轻度增生,伴炎性细胞浸润:同种异体血管组内膜极度增厚、坏死,管腔明显狭窄,伴不同程度的血栓机化.结论:将兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管支架上,可获得一种具有良好生物相容性和通畅率的生物人工血管.
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过氧乙酸对脱细胞血管支架生物学特性影响的实验研究
目的 探讨使用体积分数为0.1％过氧乙酸处理脱细胞血管支架的生物相容性和生物力学特征,观察其作为生物材料消毒剂对于脱细胞血管支架材料生物特性的影响.方法 选取2.0 ～2.5 kg大耳白兔10只,在无菌条件下切取新鲜的兔股动脉,经反复冻融与超高压处理后,以15μg/mlR-Nase A,150 μg/ml D-Nase Ⅰ核酸酶进行脱细胞处理,室温下放置于体积分数为0.1％过氧乙酸溶液中3h,对其进行组织学评估,观察其超微结构、生物力学,以及细胞毒性的测定.结果 经体积分数为0.1％过氧乙酸处理后的脱细胞血管支架,在组织结构、生物力学及细胞毒性方面与正常对照组之间无明显差异.结论 采用体积分数为0.1％过氧乙酸处理脱细胞血管支架,对其生物相容性和生物力学特性无明显影响,或许可以作为脱细胞组织工程血管生物支架消毒剂的一种选择.
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反复冻融与超高压处理制备脱细胞组织工程血管支架的实验研究
目的 观察不同浓度核酸酶对经反复冻溶加超高压处理后兔股动脉的脱细胞效果.方法 无菌条件下采取新鲜兔股动脉,去血管外膜后将材料分为未处理组、冻融组、超高压处理组、冻融+超高压处理,后三组分别于-80℃冷冻2 h、37℃水浴复温15 min,上述冻融过程反复进行3次.5000大气压超高压(4℃)处理20min将供体来源细胞压碎,结合不同浓度核酸酶进行消化,脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架.通过组织学和超微结构观察,对不同浓度核酸酶脱细胞效果进行评价,测定反复冻融加超高压处理对血管材料生物力学特性的影响.结果 组织学显示,经反复冻溶加超高压处理后的血管材料,可在较短的时间内被较低浓度核酸酶除去血管支架内的供体细胞成分,脱细胞支架的主要生物力学性能指标与正常血管相比,无明显改变.结论 反复冻溶加超高压脱细胞方法可以明显缩短脱细胞血管基质的制备周期,为脱细胞组织工程血管支架的快速高效制备提供一种新的思路和方法.
关键词： 组织工程血管 超高压 反复冻融 脱细胞组织工程血管支架 -
超声空化法对脱细胞血管支架组织结构及生物力学特性影响的实验研究
目的 利用一定强度的超声波,在不影响支架材料本身生物学特性的前提下,使脱细胞血管支架的胶原纤维疏松化,以利于种子细胞的黏附和长入.方法 在无菌条件下取新鲜兔股动脉,反复冻溶+超高压处理后,利用核酸酶进行消化,脱去残留细胞碎片,形成脱细胞血管支架.将不同强度的超声作用于脱细胞血管支架,通过对处理后支架材料的组织结构、生物力学特性的检测和观察,得出佳的超声处理强度.结果 超声处理参数为强度300 W,处理间隔1s,处理时长1 min时,脱细胞血管支架材料疏松化程度较未处理前明显提高,而生物力学强度无明显降低.结论 超声空化法可以改善脱细胞血管支架材料结构致密的问题,为组织工程血管支架材料的研究提供新的思路和方法.
