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人脐动脉脱细胞支架的制备及其生物相容性
目的:制备脱细胞人脐动脉支架并检测其与内皮细胞的相容性.方法:实验于2005-11/2006-12在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.实验材料:健康新生儿的新鲜脐带(产妇知情同意并自愿捐献).实验方法:①脱细胞脐动脉支架的制备:分离脐动脉放于离心管中,先用低渗后用等渗的十二烷基硫酸钠处理,再用核酸酶消化.脱细胞脐动脉支架作苏木精-伊红染色、Movat五色法染色及透射电镜观察.②支架与内皮细胞共培养:将脱细胞脐动脉支架切成小块,移入24孔培养板中.实验组每孔接种1.5 mL的脐静脉内皮细胞悬液,对照组未种细胞,只加1.5 mL的培养液,1周后进行扫描电镜观察.实验评估:①脱细胞脐动脉支架的形态.②血管内皮细胞在脱细胞脐动脉支架上黏附生长情况.结果:①脱细胞脐动脉支架的形态:光镜下对照组样品中观察到深蓝色的细胞核,实验组细胞结构被完全破坏,核破碎后被彻底清除,未见核碎片,血管壁纤维组织染成红色,呈整齐排列,组织结构未见明显的疏松;Movat五色法染色显示,脱细胞血管无红色的细胞质和黑色的细胞核,只见呈现整齐排列的波浪状黑色的弹性纤维,其间散布着蓝色的糖蛋白和网状纤维;透射电镜下观察到交错排列的胶原纤维和弹性纤维,有少量碎片存在,未见细胞样结构.②血管内皮细胞在脱细胞脐动脉支架上黏附生长情况:脐静脉内皮细胞种植于脱细胞脐动脉支架后,扫描电镜观察到可黏附生长并形成完整内膜层.结论:用十二烷基硫酸钠和核酸酶联合消化人脐动脉能够制备良好的脱细胞血管支架,并且对内皮细胞有良好的组织相容性.
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脐静脉内皮细胞低密度种植构建组织工程血管
背景:种子细胞来源不足是组织工程研究领域的难题之一,如何充分有效的利用有限的种子细胞,是一个值得深入研究的课题.目的:拟验证脐静脉内皮细胞低密度种植于脱细胞猪动脉支架实现血管内皮化的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-10/2007-04在潍坊医学院生物化学实验室完成.材料:取新鲜猪颈动脉制备脱血管支架;新鲜脐带由潍坊人民医院产科提供,用于内皮细胞的分离和培养.方法:十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸钠联合处理获取脱细胞猪动脉支架.0.1%胶原酶灌注获取脐静脉内皮细胞,光镜和免疫组织化学罄定.分别将细胞以2×105 cm-2低密度和2×106cm-2高密度种植于支架,静态培养11 d.主要观察指标:DAPI染色法连续观察内皮细胞在支架上的生长情况.第11天对支架进行苏木精--伊红染色,扫描电镜观察,ELISA检测2×105 cm-2低密度和2×106 cm-2高密度培养液纤维连接蛋白的表达.结果:脱细胞支架细胞成分完全去除,胞外基质保存完好;细胞呈梭形或多角形,核仁清晰,呈典犁的铺路石样;免疫荧光检测可见细胞胞浆内有颗粒状红色阳性信号.采用DAPI法连续动态观察内皮细胞在支架上生长良好,贴璧较好;苏木精-伊红染色显示支架表面形成连续融合单层细胞:扫描电镜可见内皮细胞单层形成,细胞争多角形,椭圆形.低密度种植的培养液中纤维连接蛋白的表达量较高密度种植的高,分别为(121±7.93)μg/106个细胞和(78.20±3.21)μ g/106个细胞.两者相比,差异有显著性意义(P<0.05).结论:脐静脉内皮细胞低密度种植于脱细胞猪动脉支架不仅可以实现血管内皮化,而且利于增强内皮细胞和细胞外基质黏附力,提高贴壁细胞的抗应切力.
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Triton-x100与丹参酚酸B制备脱细胞血管支架及其生物力学性能
背景:脱细胞血管支架具有优良性能,但是在其制备过程中其生物力学性能出现不同程度的降低.目的:观察在组织工程制备脱细胞血管支架中丹参酚酸B的应用前景.方法:经Triton-x100单独处理,Triton-x100-丹参酚酸B联合处理制备脱细胞血管支架,分别设为Tx组和Tx-sal组,对其进行形态学观察、组织厚度测量、孔隙率检测及生物力学特性检测,比较在应用丹参酚酸B后处理之后脱细胞血管支架在形态学等各种指标上的变化.结果与结论:Tx组和Tx-sal组的血管管壁厚度及血管孔隙率差异无显著性意义(P>0.05),形态学无明显变化.Tx-sal组的脱细胞血管支架可以较完好地保留血管壁的胶原纤维和弹性纤维,抗拉强度、大变形量、断裂伸长比、爆裂压力及缝合强度均优于Tx组(P<0.05).结果证实,Triton-x100联合丹参酚酸B处理能够成功制备脱细胞效果良好、生物力学性能优良的脱细胞血管支架.
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过氧乙酸对脱细胞血管支架生物学特性影响的实验研究
目的 探讨使用体积分数为0.1％过氧乙酸处理脱细胞血管支架的生物相容性和生物力学特征,观察其作为生物材料消毒剂对于脱细胞血管支架材料生物特性的影响.方法 选取2.0 ～2.5 kg大耳白兔10只,在无菌条件下切取新鲜的兔股动脉,经反复冻融与超高压处理后,以15μg/mlR-Nase A,150 μg/ml D-Nase Ⅰ核酸酶进行脱细胞处理,室温下放置于体积分数为0.1％过氧乙酸溶液中3h,对其进行组织学评估,观察其超微结构、生物力学,以及细胞毒性的测定.结果 经体积分数为0.1％过氧乙酸处理后的脱细胞血管支架,在组织结构、生物力学及细胞毒性方面与正常对照组之间无明显差异.结论 采用体积分数为0.1％过氧乙酸处理脱细胞血管支架,对其生物相容性和生物力学特性无明显影响,或许可以作为脱细胞组织工程血管生物支架消毒剂的一种选择.
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超声空化法对脱细胞血管支架组织结构及生物力学特性影响的实验研究
目的 利用一定强度的超声波,在不影响支架材料本身生物学特性的前提下,使脱细胞血管支架的胶原纤维疏松化,以利于种子细胞的黏附和长入.方法 在无菌条件下取新鲜兔股动脉,反复冻溶+超高压处理后,利用核酸酶进行消化,脱去残留细胞碎片,形成脱细胞血管支架.将不同强度的超声作用于脱细胞血管支架,通过对处理后支架材料的组织结构、生物力学特性的检测和观察,得出佳的超声处理强度.结果 超声处理参数为强度300 W,处理间隔1s,处理时长1 min时,脱细胞血管支架材料疏松化程度较未处理前明显提高,而生物力学强度无明显降低.结论 超声空化法可以改善脱细胞血管支架材料结构致密的问题,为组织工程血管支架材料的研究提供新的思路和方法.
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超声空化法制备脱细胞血管支架生物学相容性的实验研究
目的 检测经强度为300 W超声处理后的脱细胞血管支架的生物相容性.方法 无菌条件下,采取新鲜兔股动脉反复冻溶+超高压处理后,利用核酸酶进行消化,脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架.将强度为300 W的超声作用于脱细胞血管支架,并对处理后支架材料的生物学相容性进行检测和观察.结果 经强度为300 W超声处理后的支架材料,其疏松化程度在明显提高的同时未发现明显的细胞毒性,且种子细胞可以长入材料内部.结论 超声空化法处理后的脱细胞血管支架材料具有较好的组织相容性,可以为组织工程血管支架的研究提供新的思路和方法.
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CD34抗体修饰的脱细胞血管支架的体内内皮化
目的 研究CD34抗体修饰的脱细胞血管支架植入动物体内后募集循环中的内皮祖细胞参与再内皮化过程的性能.方法 新鲜的羊前肢动脉经反复冻融和超高压处理,SDS彻底去除细胞.通过光交联法将CD34抗体固定于脱细胞血管内腔面.20只新西兰大白兔右下腹做一带蒂皮瓣,皮瓣供血动脉为股动脉的分支血管,血管移植部位选取股动脉,做1 cm长的全段缺损,随机分为2组(n=10),实验组选用CD34抗体修饰的脱细胞血管支架,对照组用未修饰的脱细胞血管支架,显微外科端端吻合替代缺损的兔股动脉.术后通过对皮瓣色泽质地的观察,了解皮瓣的血供情况;行彩色多普勒,数字减影血管造影检查和病理切片观察移植血管的通畅情况及细胞黏附情况.结果 实验组皮瓣术后血运较好,对照组皮瓣术后肿胀坏死.彩色多普勒、数字减影血管造影检查显示,实验组移植术后1周有3只动物发生血管闭塞,另7只动物在术后4周血管仍通畅、无明显狭窄;对照组术后1周无1只动物血管通畅.实验组术后4周解剖移植血管,H-E染色显示脱细胞血管支架表面形成连续融合单层细胞,管腔无明显狭窄;对照组术后1周解剖移植血管可见血栓形成,H-E染色显示血管腔内表面缺乏细胞覆盖.结论 CD34抗体修饰的脱细胞血管支架在早期抗凝及通畅率上均优于未经修饰的脱细胞血管支架.
