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阳离子磷酸胆碱聚合物载AT1受体反义寡核苷酸转染大鼠心肌成纤维细胞的研究
目的：探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体的反义寡核苷酸(AS-ODN)对离体培养的大鼠心肌成纤维细胞 AT1受体及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法：MTT 法检测 MPC与心肌成纤维细胞的细胞相容性；应用激光扫描共聚焦显微镜(CLAM)检测复合物在细胞内的定位，流式细胞仪(FCM)检测转染效率及荧光强度， Western blot检测AT1受体蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果：MPC浓度＞40μg/mL时才出现明显细胞毒性，激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围，少量分布于细胞核内。流式结果显示转染效率及荧光强度随N/P比增加而明显增大。Western blot结果显示，转染复合物后各组细胞AT1受体及Ⅰ型胶原蛋白的表达也相应减少。结论：MPC30-DEA70在安全浓度范围内就能够携带AT1R-ASODN以较高的转染率进入离体培养的大鼠心肌成纤维细胞，并成功靶向抑制AT1R及Ⅰ型胶原蛋白的表达。从而可以推断阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载反义寡核苷酸(AS-ODN)，靶向性抑制基因的表达，为新型非病毒性基因载体的研究提供了一定的理论依据。
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阳离子多聚物纳米基因载体系统的研究进展
阳离子多聚物能与DNA通过静电吸附作用而自组装成纳米微粒,保护DNA防止被核酸酶降解.阳离子多聚物由于具有合成简便、储存稳定、目的基因容量大、特异靶向性强、免疫原性低等优点被用作非病毒基因载体.阳离子多聚物按特性可分为两类:人工合成型和天然生物型.常见的人工合成型阳离子多聚物基因载体主要有:多聚左旋赖氨酸[poly(L-lysine),PLL],多聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)和星状树突体[Polyamidoamine(PAMAM)dendrimers]等:天然生物型阳离子多聚物基因载体主要有壳聚糖及其衍生物和明胶等.本文重点讨论了阳离子多聚物介导的基因导入细胞机理和基因进行靶向性转移的策略,详细论述了各种阳离子多聚物用作基因载体的性能特点,后对非病毒基因载体的发展作出展望.
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信号响应性基因载体及其应用研究
获得合适的基因载体是基因治疗取得成功的关键因素之一.由于病毒载体存在安全隐患问题,人们致力于非病毒载体的研究,但其递送效果仍不理想.为了提高其基因递送效率,改善其靶向性及特异性,并调控其在体内及细胞内的动态,研发具有响应机体内外各种物理、化学及生物信号功能的非病毒载体,逐渐形成了一个重要的研究方向,受到学术界与产业界的极大关注.本文从信号的性质及来源上,将非病毒基因载体分为响应外部物理信号和响应内部化学与生物信号;从响应模式上,将其分为响应单一信号和响应多种信号.系统阐述了此类载体的结构特点、作用机理,并对其研究进展和实际应用进行了综合评述.
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非病毒载体基因递送系统的研究进展
非病毒载体基因递送系统是相对于以病毒为载体的基因递送系统的另一种基因递送系统.具有高安全性、低免疫原性及易于生产的特性.本文就非病毒基因载体的种类、在疾病治疗中的应用前景及存在的主要问题作一综述.
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BACE1-siRNA纳米复合物对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆和相关蛋白表达的影响
目的:探讨尾静脉注射分枝状聚谷氨酸-聚丙烯亚胺-乳铁蛋白/β分泌酶小干扰RNA(MP-PPI-Lf/BACE1-siRNA)纳米复合物对阿尔茨海默病模型小鼠学习、记忆能力和β分泌酶(BACE1)、p淀粉样蛋白(Aβ)的蛋白表达量的影响.方法:将24只6月龄的APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、MP-G1.0PPI组、MP-G1.0PPI-Lf(20:1)组和MP-G1.0PPI-Lf(40:1)组,每组6只.模型组给予生理盐水,其他3组分别多次通过尾静脉注射纳米复合物,同月龄同背景C57BL/6J小鼠6只作为正常对照组.给药后1周,各组进行Morris水迷宫实验检测行为学改变,蛋白质印迹法(Western blotting)检测脑组织中BACE1和Aβ的蛋白表达量.结果:与模型组相比,MP-G1.0PPI-Lf(20∶1)组和MP-G1.0PPI-Lf(40∶1)组小鼠的逃避潜伏期明显缩短,游泳距离明显减小(P＜0.05);穿越平台的次数增加,但无显著性差异.同时,MP-G1.0PPI组的BACE1及Aβ的蛋白表达量有显著性下降(P＜0.05);MP-G1.0PPI-Lf(20∶1)组和MP-G1.0PPI-Lf(40∶1)组的蛋白表达量降低更为明显,结果有显著性差异(P＜0.01).结论:尾静注射MP-PPI-Lf/BACE1-siRNA纳米复合物能提高阿尔茨海默病模型小鼠的学习和记忆能力,同时可使BACE1及Aβ的蛋白表达量下降.
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不同物质修饰的阳离子脂质体的研究进展
近年来,非病毒基因载体中的阳离子脂质体由于其低细胞毒性、高转染率和生物相容性好等优点受到关注.阳离子脂质体由亲水性头部,链接键和疏水性尾部3个部分组成,它们对阳离子脂质体的结构和生物性能,特别是对其作为非病毒基因载体极其重要的细胞毒性和转染效率有很大的影响.本文将基于近年来阳离子脂质体的新研究,对以糖类、氨基酸及多肽、酒石酸、环状化合物和叶酸修饰的及以氨基甲酸酯为连接键的阳离子脂质体的结构、物理性质和生物性能进行介绍和分析,旨在对阳离子脂质体的进一步研究和临床应用提供参考.
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PEG-PEI共聚物/DNA复合物的物理化学性能研究
目的 研究合成的非病毒基因载体材料PEG-PEI共聚物与DNA形成复合物的各项物理化学性能指标,为PEG-PEI共聚物作为非病毒基因载体介导体内外基因传递的研究奠定基础.方法 将含PEG不同相对分子质量和接枝量的PEG-PEI共聚物,与DNA形成复合物.测定了PEG-PEI/DNA复合物的粒径、Zeta电位,结构形态、在水溶液中的溶解牲及共聚物的缓冲容量,分析了接枝PEG对各项物理化学性能的影响.结果 接枝了PEG后,PEG-PEI/DNA复合物的粒径都明显减小,Zeta电位有一定程度的下降,接枝相对分子质量较大的PEG可使Zeta电位下降较多,亲水链段PEG对降低粒子间的聚集和增加溶解性起到了关键性的作用.接枝PEG的量对引起的内含体破裂并释放DNA的质子海绵效应不会产生明显影响.结论 形成PEG-PEI共聚物后,对PEI/DNA复合物的物理化学性能有一定的改善作用,使复合物更适宜用于体内基因转导.
关键词： PEG-PEI共聚物 非病毒基因载体 物理化学性能 -
载鱼精蛋白-pDNA复合物固体脂质纳米粒的初步研究
目的 制备非病毒基因载体载鱼精蛋白-pDNA复合物的固体脂质纳米粒(PD-SLN),PD-SLN由多聚阳离子缩合DNA内核与一个脂质外壳组成,从而构成多功能信封式纳米载体(multifunctional envelope-type nano device,MEND)结构,研究其特征,对DNA的保护作用以及DNA的体外释放性质.方法 分别采用溶剂扩散法和复乳法制备纳米粒;用透射电镜观察形态;用Zeta电位测定仪测定粒径、多分散指数和Zeta电位;用荧光分光光度法测定基因包封率;分别用琼脂糖凝胶电泳观察复合物及PD-SLN保护pDNA抵抗剧烈外力和核酸酶的降解情况;采用双室扩散法对PD-SLN进行体外释放研究.结果 用2种方法制备的SLN呈球形和类球形,平均粒径分别为(231±13.7)和(627±22.9)nm,Zeta电位分别为(-17.8±3.2)和(-25.2±2.7)mV,包封率分别为(41.5±3.62)%和(56.5±5.28)%.pDNA保护性试验表明,PD-SLN对pDNA有保护作用.体外释放实验结果表明PD-SLN缓释能力强.结论 PD-SLN是一种制备工艺简单,体外缓释能力好,对pDNA保护性强,具有一定应用前景的非病毒基因载体.
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葡聚糖-寡胺纳米粒基因载体的制备及表征
目的制备聚阳离子纳米粒非病毒基因载体:葡聚糖-寡胺化合物.方法以葡聚糖、过碘酸钠、精胺等为反应物,经多步化学合成制备了该载体;并以红外光谱测定仪、激光纳米粒度测定仪、透射电子显微镜对其进行了理化表征;以绿色荧光蛋白基因为报告基因考察所制备载体的基因转染效能.结果葡聚糖与寡胺间以共价键连接成稳定的纳米粒基因载体,载体平均粒径为9.0 nm,Zeta电位为+31.1 mV、形状为类圆形;载体具有较高的基因转染率.结论实验结果表明,文中方法可以合成出优良的聚阳离子纳米粒非病毒基因载体.
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肝细胞靶向性半乳糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米基因载体的合成及其理化特性
背景:对聚乙二醇一聚乙烯亚胺进行半乳糖化修饰,可使其成为具有肝细胞靶向性的纳米基因载体半乳糖化聚乙二醇一聚乙烯亚胺[GalactosyIated (ethylene glycol)-graft-polyethylenimine,Gal-PEG-PEI]目的:合成Gal-PEG-PEI,考察其基本理化特征,为下一步的转染研究提供参考.设计、时间及地点;对比观察基因工程实验,于2007-10/2008 06在中山大学生物医学上程中心完成.材料:两步法合成Gal-PEG-PEI.方法:应用纳米粒径-zeta电位仪、透射电镜、凝胶阻滞实验和EB结合实验测定Gal-PEG-PEI与psiRNA复合物的理化性质,CCK-8法榆测其细胞毒性,纳米复合物转染HepG2细胞并观察其转染效率.主要观察指标:Gal-PEG-PEI/psiRNA的粒径、zeta电位及形态:包覆效率;细胞毒性实验结果;肝脏靶向性转染结果.结果:Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径随N/P的增大而减小,小粒径为81.1 nm,而zeta电位随Gal-PEG-PEI中氨基与psiRNA磷酸基比例的增大呈上升趋势;Gal-PEG-PEI对siRNA质粒有较好的包覆效率.Gal-PEG-PEI载体的细胞毒性小丁聚乙烯亚胺而其转染效率高于聚乙烯亚胺.结论:成功合成Cad-PEG-PEI纳米基因载体,表现出良好的肝细胞靶向性,且细胞毒性较小.
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超顺磁性壳聚糖明胶微球作为缓释基因载体的磁转染及释放
背景:利用缓释技术将成血管基因转染至细胞是组织工程骨充分血管化的关键,而选择安全有效的基因载体至关重要.目的:制备超顺磁性壳聚糖纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIOCN)与超顺磁场壳聚糖质粒明胶微球(superparamagnetic chitosan plasmid gelatin microspheres,SPCPGM),并对其进行表征.方法:利用脱水缩合反应制备SPIOCN,对其分子结构、形态和粒径、饱和磁化强度、ζ电位及DNA结合能力进行表征.将SPIOCN溶液与成骨肉瘤细胞MG-63共孵育24 h,采用透射电镜观察细胞吞噬SPIOCN的过程.制备SPCPGM与非磁性壳聚糖明胶微球,将其填入人工多孔骨植入体中,在37℃的PBS(pH=7.4)中进行体外药物溶出实验,采用振荡磁场干预,测定质粒释放量.取成骨肉瘤细胞MG-63及人脐静脉内皮细胞HUVEC-1,分4组转染,PolyMag200(商业化磁转染试剂)/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pDNA质粒组(对照组),转染24 h后,利用倒置荧光显微镜与流式细胞仪检测转染效果.将人脐静脉内皮细胞HUVEC-1分4组培养,PolyMag200/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pDNA质粒组(对照组),培养24,48,72 h后检测细胞存活率.结果与结论:①SPIOCN的平均粒径为(187±24)nm,饱和磁化强度为(20.3±4.5)emu/g,ζ电位为(9.5±2.4)mV,具有结合保护质粒DNA转染MG-63细胞及HUVEC-1细胞的能力;②SPIOCN贴附细胞膜后,通过胞膜内吞作用进入细胞,细胞浆内可见散布吞噬SPIOCN的内涵体;③在磁场干预下,SPCPGM多孔骨植入体的质粒释放量明显高于非磁性壳聚糖明胶微球多孔骨植入体(P<0.05);④转染MG-63或HUVEC-1细胞后,PolyMag200/pDNA+静磁场组转染效率高于其余3组(P<0.05),SPIOCN/pDNA+静磁场组高于SPIOCN/pDNA组及对照组(P<0.05);⑤与对照组比较,SPIOCN/pDNA+静磁场组、PolyMag200/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率降低(P<0.05),而SPIOCN/pDNA组细胞存活率无明显变化;SPIOCN/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率高于PolyMag200/pDNA+静磁场组(P<0.05);⑥结果表明,SPIOCN具有粒径小、分散性好、毒性低、超顺磁性及结合保护DNA转染细胞的特点,振荡磁场联合SPCPGM是一种较理想的缓释基因载体系统.
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聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒的制备及介导体外转染关节软骨细胞
背景：壳聚糖对软骨细胞具有良好的生物相容性和可降解性，但存在基因转染效率偏低的缺陷。目的：构建负载增强型绿色荧光蛋白基因的聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA 纳米粒，检测其理化性能，以及体外对关节软骨细胞的基因转染效率。方法：将聚乙烯亚胺共价连接于壳聚糖骨架上构建聚乙烯亚胺-壳聚糖复合物，再将聚乙烯亚胺-壳聚糖与负载增强型绿色荧光蛋白基因的质粒 DNA 以复凝聚法制成纳米粒，以扫描电镜检测纳米粒形态，Zeta 电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位；凝胶电泳阻滞实验观察聚乙烯亚胺-壳聚糖和质粒DNA的结合力。以聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒、裸质粒DNA、脂质体2000及壳聚糖/DNA纳米粒转染体外培养的兔关节软骨细胞，流式细胞仪及荧光显微镜检测基因转染率；激光共聚焦显微镜检测DNA的入核情况。结果与结论：聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA 纳米粒多呈球形，粒径为(154.6±18.6) nm，表面 Zeta 电位为(24.68±6.82) mV，可有效保护质粒DNA免受 DNaseⅠ的降解。体外转染实验证明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能介导增强型绿色荧光蛋白基因转染关节软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白，转染率达(23.80±1.74)%，转染率高于裸质粒DNA组及壳聚糖/DNA纳米粒组(P<0.05)，与脂质体2000组无显著差别(P=0.522)。表明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能有效保护质粒DNA免受核酸酶降解，对关节软骨细胞有良好的基因转染能力。
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交联聚乙烯亚胺衍生物的构建及其转染COS-7细胞的研究
目的:优化构建交联聚乙烯亚胺( Polyethylenemine,PEI)衍生物PEI-Bu,研究其对非洲绿猴肾成纤维细胞系(COS-7)的转染活性和细胞毒性.方法:以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,琼脂糖凝胶电泳考察其复合质粒DNA的能力,MTT法检测PEI-Bu对COS-7的毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/DNA复合物在COS-7细胞的转染活性.结果:凝胶电泳表明PEI-Bu/DNA在质量比大于1时即具有复合DNA的能力,PEI-Bu的细胞毒性随浓度增大而增大,在同一浓度下PEI-Bu的细胞毒性小于PEI 25kDa,(P＜0.05),PEI-Bu/DNA在质量比为5时达到高转染活性,高于PEI 25 kDa(P＜0.01),并与Lipofectamine2000相当(P＞0.05).结论:PEI-Bu在COS-7细胞中是一种低细胞毒性、高转染活性的非病毒基因载体(与商业化的PEI 25kDa比较),其在基因治疗领域中具有潜在的应用前景.
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以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒基因载体的构建及其转染大鼠肝细胞的研究
目的 构建交联聚乙烯亚胺(Polyethylenemine,PEI)衍生物PEI-Bu,研究其对大鼠肝细胞系BRL-3A的细胞毒性和转染效率.方法 以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,用凝胶渗透色谱法(GPC)测定分子量,动态光散射法(DLS)测定PEI-Bu/pDNA复合物的粒径和Zeta电位,琼脂糖凝胶电泳考察其复合质粒DNA的能力.MTT法榆测PEI-Bu对BRL-3A的细胞毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/pDNA复合物在BRL-3A细胞中的转染效率.结果 GPC 测定分子量为Mw4289Da,多分散指数1.31,复合物的粒径为138-16lnm,Zeta电位为2.4-4.3mV,凝胶电泳表明在质量比大于1时 PEI-Bu 具有复合DNA的能力,在同一浓度下PEI-Bu的细胞的毒性小于PEI 25kDa (p<0.01),PEI-Bu/pDNA在质量比为5时达到高转染效率,高于PEl25kDa (p<0.01).并与Lipofectamine2000 相当 (P>0.05).结论 PEI-Bu对BRL-3A 细胞是一种低细胞毒性、高转染效率的非病毒基因载体,在肝细胞基因治疗领域中具有潜在的应用前景.
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聚氨基酯作为基因载体的研究进展
随着基因治疗研究的不断深入,寻求一种高效、安全、靶向表达的载体已成为了基因治疗的核心问题之一.聚氨基酯(poly amino ester,PAE)作为一种新型的阳离子聚合物基因载体,具有原料廉价、合成简单、结构多样、可降解、细胞毒性低和转染效率高等优点,已越来越受到人们的关注.本文将从聚氨基酯的合成途径、理化性质、聚氨基酯/DNA纳米粒的制备及聚氨基酯/DNA纳米粒转染效率和影响因素等方面详细阐述了近年来聚氨基酯作为基因载体的研究进展.
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氧化还原调控的甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺非病毒基因载体的研制
合成了氧化还原调控的甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺[methoxy poly (ethylene glycol)-SS-polyethylenimine,mPEG-SS-PEI].采用薄层色谱验证了该聚合物中二硫键的存在.琼脂糖凝胶电泳结果显示,mPEG-SS-PEI-pEGFP复合物在含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中稳定.透射电镜观察表明,不含二硫键的mPEG-PEI及mPEG-SS-PEI 与pEGFP复合物的粒径均约为200 nm.体外转染试验中,荧光显微镜定性及流式细胞定量结果均表明,与mPEG-PEIpEGFP相比,mPEG-SS-PEI-pEGFP能显著提高对U87细胞的转染效率.原因是mPEG-SS-PEI-pEGFP复合物进入细胞后能在较高浓度谷胱甘肽的还原下脱去PEG,从而恢复PEI的质子泵效应.并且,聚合物中加入二硫键未显著增加PEG化PEI的体外细胞毒性.
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聚乙烯亚胺衍生物作为非病毒基因载体的研究进展
综述了通过结构修饰获得的各类聚乙烯亚胺(PEI)衍生物,如PEG修饰、小分子PEI共聚、连接配体或其它高分子骨架物等,及其在基因转染和细胞毒性方面的研究进展.
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透明质酸修饰阳离子脂质体的制备及初步评价
制备透明质酸(Hyaluronic acid,HA)修饰的载基因阳离子脂质体三元复合物(HA/liposome/DNA ternary complexes,TC),评价其物理化学和生物学性质.采用薄膜分散法制备空白阳离子脂质体(Liposome),与DNA 孵育得liposome/DNA脂质复合物(Lipo/DNA),将其与HA孵育即得TC.考察其物理化学性质、体外抗核酸酶能力、血浆稳定性、细胞毒性及体外转染效率.制备的liposome、Lipo/DNA、TC均呈类球形,粒径分别为(93.1±3.0),(156.6±5.4),(234.8±2.7) nm;Zeta电位分别为(43.71±1.33),(29.00±0.71),(-22.13±2.94)mV;TC与核酸酶孵育4h,其中的DNA几乎无降解;TC与血浆蛋白孵育24h内吸光度变化不大;细胞毒性与Lipo/DNA相比,显著降低;体外转染实验显示TC在有、无血清条件下均有较好的转染效率.TC是一种制备工艺简单、细胞毒性低、体外转染效率高、极具应用潜力的非病毒纳米基因载体.
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纳米粒沉淀法制备阳离子载基因PLA-PEG纳米粒
目的 建立纳米粒沉淀法制备阳离子PLA-PEG纳米粒的方法.方法 采用单因素设计考察不同影响因素对纳米粒粒径大小的影响,在单因素考察的基础上采用正交设计优化处方,制备了粒径较小,正电荷适中的阳离子PLA-PEG纳米粒.并对纳米粒的物理性质如物理形态,平均粒径,粒度分布,Zeta电位,DNA结合率,体外细胞转染能力等进行了考察.结果 采用纳米粒沉淀法,通过优化处方和工艺制得的纳米粒外观圆整,呈类球形,大小均匀,平均粒径为89.7 nm,粒径分布指数为0.185,表面荷较高的正电荷,Zeta电位为+28.9 mV,能够高效的结合DNA且能够成功的转染Hela细胞.结论 优化确定了纳米粒沉淀法制备阳离子PLA-PEG纳米粒的处方和工艺,可以制备满足细胞转染要求的阳离子载基因纳米粒.
关键词： 纳米粒沉淀法 PLA-PEG纳米粒 非病毒基因载体 制备 -
磷酸胆碱聚合物载TGF-β1反义寡核苷酸转染血管外膜成纤维细胞对TGF-β1的影响
目的：观察新型阳离子磷酸胆碱聚合物 MPC30-DEA70能否有效地转染针对转化生长因子β1（transfor-ming growth factor-β1，TGF-β1）的反义寡核苷酸（AS-ODN）进入到血管外膜成纤维细胞中及转染后对血管外膜成纤维细胞内TGF-β1表达的影响，为MPC30-DEA70聚合物作为药物基因治疗载体在心血管疾病中的运用奠定基础。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞；应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN（ FAM标记）在细胞内的分布和定位；流式细胞仪（ FCM）检测二者的细胞转染效率﹑荧光强度；免疫印迹实验（Western blot）检测TGF-β1细胞内表达。结果①原代培养的细胞呈纺锤形，多角形或者不规则形，细胞核较大，数量1～2个不等，轮廓清楚，核仁大而明显，呈椭圆形；②激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围；③流式结果显示转染效率及荧光强度随N/P比增加而明显增大；④Western blot结果显示随着N/P比值的增大，TGF-β1的蛋白表达明显下降（ P＜0．05）。结论 MPC30-DEA70能够携带TGF-β1-AS-ODN进入离体培养的大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞，并能下调TGF-β1蛋白的表达。
