风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价

原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性.将RV衣壳蛋白C aa 3～29、aa 96～123以及包膜糖蛋白E1 aa208～247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别.分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgMELISA血清学检测中.

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的 以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用.方法 利用PCR 技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平.以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性.结果 经双酶切及DNA 测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确.与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ.攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长.结论 弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性.

汉坦病毒G2糖蛋白多表位抗原的表达及应用

目的 对汉坦病毒G2糖蛋白多表位抗原(multi-epitope antigen,MEA)进行原核表达和纯化,建立MEA-ELISA方法并用于肾综合征出血热(HFRS)患者血清特异性抗体的检测. 方法 利用pET原核表达系统表达MEA,并进行镍亲和纯化;利用Western blot方法对MEA进行免疫反应性鉴定,并建立MEA-ELISA方法,用于检测HFRS患者血清特异性抗体. 结果 原核表达系统E coli BL21/pET32a-mea能表达分子质量单位为36.9 ku的MEA蛋白,纯化后的蛋白浓度为0.15 mg/ml,纯度＞95％,Western blot显示目的蛋白能被HFRS患者血清识别.用建立的MEA-ELISA方法检测120例HFRS患者血清的阳性率为90.83％,检测60例健康人血清全部为阴性. 结论 重组表达蛋白MEA具有良好的免疫反应性,建立的MEA-ELISA方法可用于HFRS患者血清特异性抗体的检测.

HIV复合多表位DNA疫苗的设计及免疫研究

目的设计新型HIV复合多表位DNA疫苗,探讨其在小鼠体内的免疫应答. 方法以HIV抗原表位为基础进行新型HIV多表位DNA疫苗的抗原分子设计,利用化学合成的方法合成全新HIV抗原基因,并构建核酸疫苗重组质粒,免疫BALB/c小鼠,利用合成的表位肽进行抗体水平、特异性淋巴细胞增殖实验、特异性CTL检测分析及迟发性超敏反应.同时,还对所设计的HIV复合多表位DNA疫苗与编码HIV全结构蛋白的DNA疫苗(pVAXI-gag-gp120)进行特异性CTL反应的比较研究. 结果所设计的新型HIV多表位DNA疫苗可在BALB/c小鼠体内诱导出针对所选表位的强表位特异性的CTL反应和抗体反应.而HIV复合多表位DNA疫苗与编码HIV全结构蛋白的DNA疫苗相比可诱导产生更强、更广泛的表位特异性的CTL应答. 结论所设计的HIV复合多表位DNA疫苗对BALB/c小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性.

丙型肝炎病毒重组蛋白抗原联合免疫的免疫原性和保护性研究

目的 研究两个丙型肝炎病毒(HCV)多表位重组抗原联合免疫后诱导的细胞免疫和体液免疫应答,以及对小鼠的保护作用.方法 用两个多表位抗原HCV-T和HCV-E1联合免疫BALB/c小鼠3次,ELISA检测血清中抗体IgG、IgG1和IgG2a滴度;后一次免疫后10 d杀死一半小鼠,取脾细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性;ELISPOT法检测分泌IFN-γ和IL4的细胞;后一次免疫后2周,在免疫小鼠的背部皮下注射106个SP2/0-NS3细胞,考察联合免疫对小鼠的保护作用;另取BALB/c小鼠,先在背部皮下注射106个SP2/0-NS3细胞,7 d后开始联合免疫,免疫3次,考察免疫治疗作用.结果 用HCV-T+HCV-E1联合免疫诱导了高滴度的HCV-E1特异性的IgG、IgG1和IgG2a抗体以及高水平的CTL活性;与单独免疫相比,联合免疫产生的分泌IFN-γ和IL-4的细胞数量有协同作用;而且联合免疫能有效预防和治疗SP2/0-NS3对小鼠的攻击.结论 HCV-T+HCV-E1联合免疫诱导了保护性的体液免疫和细胞免疫应答,有望进一步开发为一种有效的重组HCV疫苗.

人偏肺病毒多表位抗原的小鼠免疫应答

目的：评价本实验室构建的人偏肺病毒多表位抗原（ MEA ）的免疫应答水平。方法4～6周龄雌性SPF级BALB／c小鼠分为7组：MEA＋含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸（ oligodeoxynucle-otides containing CpG motifs ，CpG ODN）腹腔注射组i．p．，MEA＋Alum腹腔注射组i．p．，MEA＋Alum＋CpG ODN腹腔注射组i．p．，MEA＋CpG ODN滴鼻组i．n．，MEA＋Alum＋CpG ODN滴鼻组i．n．，以上5组分别于0 d、14 d、21 d免疫3次；MEA＋Quickantibody5W肌肉注射组i．m．，分别于0 d、21 d免疫2次，同时设未处理对照组，末次免疫后2周杀鼠进行相应检测。采用ELISA法检测血清IgG、IgG1、IgG2a和IgA抗体，MTS法进行淋巴细胞增殖试验，LDH法检测杀伤性T淋巴细胞杀伤活性，流式细胞仪检测CD4＋／CD8＋T细胞，悬浮芯片法检测脾细胞分泌细胞因子。结果 MEA免疫后除滴鼻免疫组外，其他组均产生了高滴度IgG抗体，抗体效价均＞104。除滴鼻免疫组外，其余各组IgG1与IgG2a抗体均显著存在。3组免疫动物血清中检测到了IgA，其中MEA＋Alum＋CpG ODN i．p．组IgA效价高为2．15×103。与对照组相比，MEA＋Alum i．p．、MEA＋Alum＋CpG ODN i．p．和 MEA＋Quickantibody5W i．m．淋巴细胞增殖指数有明显增高（P＜0．05）。腹腔免疫组及MEA＋Quickantibody5W 肌肉免疫组CTL杀伤活性均明显增强（P＜0．05）。 MEA＋CpG ODN i．p组Th1型细胞因子均分泌增多，其中IL-2和IFN-γ增幅明显，3种Th2型细胞因子分泌均明显增多。 MEA＋Alum i．p．组IFN-γ稍有增加， IL-4、IL-5、IL-10均明显增加，MEA＋Alum＋CpG ODN i．p．组IFN-γ增幅明显，IL-4、IL-5、IL-10均明显增加。 MEA＋Quickantibody5W i．m组IFN-γ增幅明显，IL-5、IL-10明显增加，GM-CSF也明显增加。除滴鼻免疫组外，其余各组脾细胞中CD4＋／CD8＋T细胞稍有增加（P＜0．05）。结论 MEA在不同佐剂作用下可产生高滴度的特异性抗体，也可激活CTL。 CpG ODN可引起Th1／Th2平衡免疫应答，CpG ODN和铝镁佐剂合用免疫效果好，商品化佐剂Quickantibody5W也可产生相似的效果。本研究为今后hMPV表位疫苗开发、诊断方法建立及hMPV流行病学研究等奠定了基础。

汉坦病毒G2糖蛋白多表位抗原基因的设计与构建

目的 构建汉坦病毒SEO型代表株L99 G2蛋白的多表位抗原基因(mea).方法 通过生物信息学软件对L99株G2蛋白氨基酸序列进行综合分析及预测,优选B细胞表位,引入GPG间隔序列串联表位.设计mea,然后应用重叠PCR法构建mea,并将其克隆到原核表达质粒pET32a(+).结果 优选出5个B细胞表位,设计并成功构建mea,PCR定向克隆获得pET32a-mea重组表达质粒.结论 首次构建了汉坦病毒G2糖蛋白mea及其原核表达系统E.coli BL21/pET32a-mea,为其表达及免疫学应用奠定基础.

人偏肺病毒多表位抗原的构建与表达

目的 构建含人偏肺病毒(hMPV)B细胞和T细胞表位的多表位抗原,并在原核系统表达,评价其免疫原性和免疫反应性.方法 以人偏肺病毒NL/1/00不同蛋白为模板,采用在线生物信息学软件Bepipred、ABCpred、Bcepred、LEPS及LBTOPE预测B细胞表位,以NetMHCpan及NetMHC预测CTL细胞表位,以NetMHCⅡ预测Th细胞表位.综合各软件预测结果,确定候选B细胞及T细胞表位,各表位间加入间隔序列“GPGPG”和“KK”,串联为多表位抗原基因mea,与pET32a(+)连接后转化E.coli BL21(DE3)宿主菌,经含氨苄的LB平板培养基筛选、鉴定获得重组pET32a(+)-mea,经IPTG诱导表达获得多表位抗原(MEA),以镍层析柱纯化,以Western blot鉴定表达蛋白,以MEA免疫小鼠,以ELISA法检测产生抗体效价,以间接免疫荧光法(IFA)检测抗体特异件.结果 共预测筛选人偏肺病毒B细胞表位6个,CTL表位4个,Th细胞表位2个,串联为多表位抗原基因mea,经与pET32a(+)重组后,转化E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG 30℃诱导5h,上清及沉淀均有目的蛋白表达.上清经镍层析柱纯化后获得重组多表位抗原MEA,浓度为1 mg/ml.Western blot检测显示,表达的MEA可与抗His抗体结合.经MEA免疫的BALB/c小鼠的抗血清经ELISA检测,抗体效价达105以上;经间接免疫荧光检测,抗血清能与感染vero-E6细胞的hMPV结合.结论 成功构建了hMPV多表位抗原基因,并在原核系统成功表达,获得多表位抗原MEA.该抗原具有很好的免疫原性和免疫反应性,并可与hMPV病毒发生结合,具有病毒特异性.

丙型肝炎病毒与恶性疟原虫复合多表位抗原基因在小鼠及家兔中免疫应答的研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)及恶性疟原虫(Pf)复合 DNA 疫苗的可行性.方法:把HCV复合多表位抗原基因PCX与Pf复合基因AB克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达载体pcDNA3/CAB,肌肉注射免疫小鼠及家兔,检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性.结果:小鼠及家兔分别于免疫后第6周及第8周可检测到抗GZ-PCX抗体,于第10周达高,滴度分别为1:400及1:3 200,但持续时间较短;免疫血清可识别Pf抗原;免疫动物还可产生针对GZ-PCX融合蛋白的迟发性超敏反应;免疫后小鼠体重正常,肝脾脏未见明显肿大,具有良好的安全性.结论:HCV/Pf双价多表位DNA抗原基因在小鼠及家兔中可诱发特异性免疫应答,但抗体的持续时间较短.

重组多克隆抗体——一类新的治疗制剂

抗体作为治疗制剂已有上百年历史,主要有抗血清和单克隆抗体,抗血清对多表位抗原的中和能力较强,但是,抗血清安全性低、供应量有限、批次间差异大、有效抗体成分低,而且不能进行基因改造;单抗药物的特异性强、重复性好、能够进行基因操作、安全性高,不过,在由多表位抗原或者是突变较快的病原体引起的疾病治疗中,单抗的疗效相对较差;重组多克隆抗体几乎拥有抗血清和单抗的所有优点,在多种疾病比如感染和癌症的治疗中将体现其巨大的优势和良好的临床应用前景.本文将对这一类新型抗体治疗制剂做简要综述.

HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性

目的 设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果.方法 检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达.重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类.结果 重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确.间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因.免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫.结论 已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性.

061 在转基因食用植物中表达的麻疹病毒多表位抗原的中和性免疫原性

细粒棘球蚴抗原B表位结构的预测分析和多表位重组抗原的构建

目的 对细粒棘球蚴抗原B (EgAgB)的3个亚单位(EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4)的反应性表位的结构进行预测分析并进行基因重组,鉴定构建的多表位重组抗原的反应性. 方法 用Bioedit和Discovery Studio Visualizer分析软件和I-TASSER在线服务器对EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位抗原序列及其不同组合方式的组合序列进行分析和结构预测.选择结构预测评分较高的表位或亚单位组合方式进行基因重组.设计特异性重叠引物,用重叠延伸PCR技术扩增目标序列.将目标序列克隆至pET32a(+)载体中构建表达质粒表达重组蛋白,表达产物经纯化后即为多表位重组抗原.采用蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定多表位重组抗原的反应性. 结果 结构预测显示,EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位的主要表位均呈“Z”字型结构,且主要表位区域亦均位于序列的中部;对拟进行组合的3个EgAgB亚单位和4个主要表位(KK36、RK30、B4-2和B4-3)的57种不同的组合方式进行了结构预测,选择6种组合方式进行重组表达.对6个多表位重组抗原(MEA-8、MEA-20、MEA-26、MEA-36、MEA-49和MEA-52)进行的Western blotting分析显示,多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应条带明显强于AgB亚单位抗原. 结论 构建的6个多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应性明显强于EgAgB亚单位抗原.

空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原的设计、表达与鉴定

构建空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,免疫动物后检测其抗血清与空肠弯曲菌菌体的反应性.从空肠弯曲菌的6个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段,将其插入原核表达载体,获得重组质粒pET-32a(+ )-CJMEA-A,经IPTG诱导后表达出25k的目标蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,Western blot和间接ELISA检测重组蛋白抗原性和抗血清反应性.结果表明目标蛋白具有良好的反应原和免疫原性,抗血清能与菌体发生反应.其抗体可用于C.jejuni免疫磁珠和免疫胶体金等检测方法的建立.

布氏杆菌表面特异性多表位抗原的串联表达与免疫磁珠的初步建立

目的 为获得布氏杆菌表面多表位抗原的特异性抗体,用于布氏杆菌免疫磁珠的构建.方法 从布氏杆菌3个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段并插入原核表达载体,转化至E.coli BL21(DE3),获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,IPTG诱导后表达出30 kDa的重组蛋白,亲和层析纯化后将其进行Western blot分析、间接ELISA鉴定和兔免疫试验,制备的抗血清经亲和层析纯化后,包被成免疫磁珠并用于布氏杆菌富集.结果 表达的重组蛋白能与牛抗布氏杆菌血清反应,其抗血清与布氏杆菌发生良好反应,纯化抗体包被的免疫磁珠能特异性吸附布氏杆菌.结论 获得的布氏杆菌特异性抗体和免疫磁珠具有良好的应用前景.

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的: 探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性.方法: 将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT.将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠, 用间接免疫ELISA法、 CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验, 检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平, 并观察其对免疫小鼠的毒副作用.结果: 用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后, 在效靶比为100∶1时, 可诱导显著地特异性CTL应答(P《0.05).ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高(P《0.05).在BPT基因原核表达蛋白的刺激下, 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著(P《0.05).RT-PCR分析表明, IL-12 mRNA的水平亦明显升高.结论: HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答, 为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据.

小鼠及家兔对丙型肝炎病毒多表位 DNA疫苗免疫应答的研究

目的探讨 HCV复合多表位 DNA疫苗的可行性。方法把 HCV多表位抗原基因 PCX克隆到真核表达载体 pREP9(RSV启动子 )及 pcDNA3 (CMV启动子 )中，构建真核表达载体 pREP9/PCX及 pcDNA3/PCX。将其肌肉注射免疫小鼠及家兔，检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平，并观察免疫小鼠的安全性。结果质粒 pREP9/PCX及 pcDNA3/PCX于免疫后第 6wk和第 10 wk时，开始可检测到抗 GZ-PCX IgG，随后抗体滴度逐渐升高，但水平较低，持续时间较短。 pcDNA3/PCX 肌肉注射免疫家兔后，于第 8wk开始出现特异性抗体，至 3个月后滴度升至 1∶ 3 200，随后也开始下降。免疫小鼠及家兔可诱发针对 GZ-PCX融合蛋白的迟发型超敏反应，并刺激淋巴细胞转化。免疫后小鼠的体重正常，肝脾脏未见明显肿大，具有良好的安全性。结论 HCV多表位基因可诱发特异性免疫应答且安全性好，为 HCV疫苗的研究提供了一定的理论及实验依据。

丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表达及免疫原性分析

目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)十表位抗原HCVe在大肠杆菌中的非融合表达及其免疫原性分析.方法:在大肠杆菌DH5α中表达非融合蛋白HCVe, 纯化该蛋白后利用Westerb blot分析其抗原反应性.免疫小鼠, 检测其免疫特异性.结果:HCVe十表位抗原能在原核表达系统中高效表达.Western blot和ELISA分析表明HCVe十表位抗原能与HCV病人阳性血清特异性结合, 并可诱发小鼠产生特异性HCV抗体.结论:表达的HCVe十表位抗原具有特异的抗原反应性及免疫原性.

结合RNAi技术的三重表达HCV DNA疫苗的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达.方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH Ⅰ位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达.结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功.在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清.结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应.为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础.