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串联表达马立克氏病病毒糖蛋白B主要抗原决定簇基因的重组鸡痘病毒的构建
马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性疾病,病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤发生单核细胞浸润为特征[1].MD是世界上重要的家禽传染病之一,是造成世界养禽业重大经济损失的一个主要原因.20世纪70年代早期MD疫苗的发现才使MD得到控制[2].
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牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、BP主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定
目的 构建无乳链球菌菌毛岛屿辅助蛋白AP1、菌毛骨架蛋白BP主要抗原域串联表达重组载体,对表达产物进行抗原性分析及鉴定. 方法 利用DNAstar Protean功能筛选AP1和BP主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、BP主要抗原决定簇基因区,PCR扩增串联体基因片段,克隆至pET-30a(+)载体后转化BL21(DE3)细胞,表达的目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定. 结果 PCR扩增出321 bp的AP1和660 bp的BP主要抗原域,经重叠延伸PCR获得966 bp的AP1、BP串联体基因片段,DNA测序表明无碱基缺失、突变和移码.构建的重组表达载体经IPTG诱导能可溶性表达分子质量约45 ku的目的蛋白,纯化后重组蛋白的纯度≥95％,Western blot分析表明,重组融合蛋白能被兔源抗无乳链球菌阳性血清识别. 结论 重叠延伸PCR获得AP1、BP主要抗原域串联体,构建的pET-30a(+)/AP1+ BP重组表达载体能以包涵体形式表达目的蛋白,表达产物具有良好的反应原性,为研究基于AP1、BP蛋白的致病机制及其免疫活性奠定了实验基础.
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串联表达大鼠心肌细胞Kir2.1 shRNA载体的构建及其体外效应
目的构建串联表达5个针对大鼠kir2.1基因shRNA的真核表达载体,观察其对该基因表达的影响.方法选择5个针对大鼠kir2.1基因的RNA干扰位点,分别设计合成相应的5对寡核苷酸链,形成双链后分别连入带有U6启动子的相应载体,反复酶切连接将表达5个kir2.1 shRNA的目的基因依次连接入载体pEGFP6-1,构建成串联真核表达载体pEGFP6-1Kir2.1,将其转染培养的大鼠心肌细胞,RT-PCR和Western印迹检测其对Kir2.1 mRNA转录和蛋白表达的影响.结果成功构建串联表达5个大鼠Kir2.1基因shRNA的真核表达载体,该载体对大鼠心肌细胞Kir2.1mRNA转录的抑制率为83.5%,对心肌细胞Kir2.1蛋白表达的抑制率为68.1%.结论串联表达多个大鼠心肌细胞Kir2.1基因shRNA真核表达载体介导的RNA干扰可以特异性抑制该基因的表达,可能成为制造生物起搏器的一种新方法.
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变形链球菌gtfS、gbpB基因的串联表达及其卵黄抗体的制备
目的:串联表达变形链球菌毒力基因gtfS、gbpB的重组融合蛋白,将其作为免疫抗原制备特异性卵黄抗体,并研究该卵黄抗体的免疫活性.方法:以变形链球菌标准菌株UA159的基因组为模板,通过PCR方法扩增gtfS的CAT区和gbpB的SYI区,以SOE-PCR方法将其串联成基因片段CAT-SYI.在限制性内切酶EcoRⅠ-HF和XhoⅠ及T4 DNA连接酶的作用下构建重组质粒pET32a-CAT-SYI,转化表达菌株E.coli BL21,用1 mmol/L IPTG诱导表达后超声破碎重组菌,将提取纯化的重组融合蛋白免疫产蛋鸡并从鸡蛋中提取卵黄抗体,利用ELISA、Western blot和斑点杂交分析该抗体的特异性和免疫活性.结果:经PCR、SOE-PCR成功扩增出约750 bp的串联基因CAT-SYI,SDS-PAGE检测结果表明其表达产物约50 kD,与目的蛋白大小符合.ELISA间接法测得卵黄抗体的效价可达1:100000以上,Western blot鉴定结果显示IgY的特异性,在相对分子量约为35 kD和70 kD处出现相应的条带,斑点杂交检测结果显示特异性卵黄抗体具有识别变形链球菌的能力.结论:制备的特异性卵黄抗体具有良好的抗变形链球菌免疫活性,为免疫防龋奠定了基础.
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牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原域的串联表达及其免疫活性
目的 构建无乳链球菌(group B Streptococcus agalactea,GBS)菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原表位域融合表达重组质粒,进行高效表达,并分析其免疫活性.方法 利用DNAstar生物信息软件Protean功能筛选BP和AP2主要抗原表位域,并引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术扩增融合BP、AP2主要抗原表位域基因,PCR扩增串联体基因片段,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)/BP+ AP2,转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白BP+ AP2经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并免疫昆明小白鼠,检测其免疫原性.结果 PCR扩增出675 bp的BP和759 bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 380 bp的BP、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码.构建的重组表达质粒经诱导后获得表达,目的蛋白相对分子质量约55 000,主要以包涵体形式存在,纯化后纯度达96％以上,浓度为2.05 mg/ml.纯化的融合蛋白能被兔抗GBS阳性血清所识别,且具有良好的免疫原性.结论 构建了GBS BP、AP2主要抗原表位域串联体重组表达质粒pET-30a(+)/BP+ AP2,表达产物具有良好的免疫活性,为进一步研究基于BP、AP2蛋白的致病机制、诊断制剂及基因工程疫苗奠定了基础.
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布氏杆菌表面特异性多表位抗原的串联表达与免疫磁珠的初步建立
目的 为获得布氏杆菌表面多表位抗原的特异性抗体,用于布氏杆菌免疫磁珠的构建.方法 从布氏杆菌3个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段并插入原核表达载体,转化至E.coli BL21(DE3),获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,IPTG诱导后表达出30 kDa的重组蛋白,亲和层析纯化后将其进行Western blot分析、间接ELISA鉴定和兔免疫试验,制备的抗血清经亲和层析纯化后,包被成免疫磁珠并用于布氏杆菌富集.结果 表达的重组蛋白能与牛抗布氏杆菌血清反应,其抗血清与布氏杆菌发生良好反应,纯化抗体包被的免疫磁珠能特异性吸附布氏杆菌.结论 获得的布氏杆菌特异性抗体和免疫磁珠具有良好的应用前景.
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RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达
目的 探讨RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达.方法 设计合成4对靶向RhoA与RhoC基因的各两对寡核苷酸序列,退火后分别克隆入shRNA表达载体;通过一系列的酶切与连接,将该4段干扰片段串联起来,构建一个同时表达4个shRNA的重组质粒.经酶切和测序鉴定重组质粒.脂质体法转染HCT116,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测各细胞中RhoA、RhoC mRNA的表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖活性.结果 经酶切和测序证实重组质粒pGenesil2.7-A1+A2+C1+C2构建成功.转染该重组质粒后细胞中RhoA、RhoC mRNA的表达水平分别为(0.78±0.11)和(0.90±0.21),明显低于空白对照组(0±0.15、0±0.09)和阴性对照组(-0.05±0.12、0.11±0.10,P＜0.05),且细胞的生长增殖率(63.8±12.5)%也显著低于对照组和质粒对照组(101.6±13.7)%(P＜0.05).结论 成功构建4个shRNA串联的重组表达载体,该载体可在体外高效表达.
