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先天性心脏病患儿体内人巨细胞病毒糖蛋白B基因型研究
目的 探讨HCMV感染和gB基因型与先天性心脏病关系.方法 2004年9月～2005年6月住院的先天性心脏病患者116人为先心组,其中仅患先天性心脏病者73人,合并肺炎43人,其中男性64人,女性52人,年龄1个月～13岁,平均(1.7±2.0)岁.对照I组为同期住院无先天性心脏病而仅患肺炎的患者98人,其中男性57人,女性41人,年龄1个月～14岁,平均(2.3±3.3)岁.对照Ⅱ组为无症状正常婴儿但尿HCMV-DNA检测为阳性,共25人,年龄1个月～12月,平均(6.9±5.3)月.应用荧光定量法检测先心组和对照Ⅰ组尿HCMV-DNA含量,应用套式PCR(nPCR)加限制性长度多态性分析(RFLP)的方法检测HCMV包膜糖蛋白B(glycoproteln B,gB)基因型.结果 先心组尿HCMV-DNA阳性率60.3%,对照Ⅰ组尿HCMV-DNA阳性率36.7%,差异有统计学意义(χ2=11.864,P<0.01);年龄1～12月先心患儿体内HCMV gB Ⅰ型占78.6%(22/28),对照Ⅱ组HCMV gBⅠ型占40.0%(10/25),差异有统计学意义(χ2=8.214,P<0.01).结论 宫内HCMV感染可能是先天性心脏病的致畸因子,gB Ⅰ型是致病优势基因.
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串联表达马立克氏病病毒糖蛋白B主要抗原决定簇基因的重组鸡痘病毒的构建
马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性疾病,病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤发生单核细胞浸润为特征[1].MD是世界上重要的家禽传染病之一,是造成世界养禽业重大经济损失的一个主要原因.20世纪70年代早期MD疫苗的发现才使MD得到控制[2].
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人巨细胞病毒临床分离株糖蛋白B基因型分析
目的分析巨细胞病毒临床分离株糖蛋白B基因型. 方法以巢式聚合酶链反应(nested-PCR)检测器官移植受者外周血细胞和输卵管妊娠患者生殖道组织中的巨细胞病毒gBn和gBcls基因并测序分型. 结果分离到44例HCMV gBn、gBcls阳性基因,32例有HCMV gBn基因分型结果,其中1型8例(25%),2型2例(6%),3型22例(69%),未见4型,分布以gBn3型为主.HCMV gBcls基因分型结果为26例,其中1型14例(54%),2型5例(20%),3型7例(26%),未见4型,gBcls基因型则散在分布,以1型为多见.21例同时得到gBn、gBcls基因分型结果,其中8例(36%)表现出基因型别不一致.表现为gBcls1-gBn3型. 结论 HCMV临床分离株,其糖蛋白基因分别属于gB基因型1～3型,并存在较多的gBcls与gBn基因型别的不对应现象,提示HCMV临床株有较高频率株内基因重组发生,是否由此导致病毒抗原性发生改变,值得进一步研究.
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人巨细胞病毒包膜糖蛋白B线性B细胞抗原表位的预测
目的：通过生物信息学方法分析人巨细胞病毒（ human cytomegalovirus ，HCMV）包膜糖蛋白B （ glycopro－tein B，gB）的结构及理化特性，预测gB的线性B细胞抗原表位。方法基于HCMV gB的序列，利用两种在线B细胞表位预测程序及DNAstar软件对gB进行预测；利用SWISS－MODEL服务器同源构建gB三级结构模型，进行进一步验证。结果与结论综合多项分析，预测得到HCMVgB的多个线性B细胞表位，为后续验证其优势中和表位，建立富含高效价中和抗体的原料血浆的筛选方法奠定了基础。
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单纯疱疹病毒壳膜蛋白22增强人巨细胞病毒糖蛋白B核酸疫苗免疫效果的体内生物学活性
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是造成先天畸形的主要病原体,HCMV糖蛋白B(glycoprotein B,gB)为HCMV重要的一种膜糖蛋白,在病毒感染及诱发机体免疫反应中起着重要作用;单纯疱疹病毒壳膜蛋白22(tegument viral protein 22,VP22)是单纯疱疹病毒的一种结构蛋白,具有很强的细胞间转移作用,可将与其融合的蛋白分子高效带入邻近细胞,提高基因转移效果.本研究拟将HCMV gB基因与VP22基因连接在一起,以增加抗原与宿主免疫系统接触的机会,制备HCMV核酸疫苗,并研究其在小鼠体内的免疫活性.
关键词： 人巨细胞病毒 糖蛋白B 单纯疱疹病毒壳膜蛋白22 核酸疫苗 免疫评价 -
婴幼儿人巨细胞病毒感染的临床表现和糖蛋白B基因分型
目的:了解婴幼儿人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染的临床表现,以及与糖蛋白B(gB)基因型的关系.方法:ELISA法检测HCMV-lgM确定的HCMV阳性的婴幼儿51例,对其不同临床症状进行分析.对其中43例患儿使用套式PCR(nPCR)法加限制性长度多态性分析(RFLP)进行HCMV gB基因分型.结果:在51例HCMV感染患儿中全身性感染和单脏器感染分别占25.49%和74.51%,HCMV包涵体病和肝炎分别占25.49%和21.57%.43例患儿HCMV gB的基因分型结果为,gBI型20例,gBⅡ型7例,gBⅢ型9例,gB Ⅰ、Ⅱ混合型4例,gBⅠ、Ⅲ混合型2例,gBⅡ、Ⅲ混合型1例,未发现gBⅣ型.gBⅠ型占46.51%.结论:婴幼儿HCMV感染临床表现种类多样;HCMV感染者以gBⅠ型HCMV占多数.
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单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的构建及细胞免疫学研究
目的:构建、制备单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)糖蛋白B DNA疫苗,检测其诱导机体产生的细胞免疫应答.方法:PCR扩增编码HSV-Ⅰ gB去除N端部分信号肽序列(39 bp)的基因片段(2 673 bp),定向插入pcDNA3载体中,构建pcDNA3-gB基因疫苗并对其进行PCR、酶切及测序鉴定.于BALB/c小鼠注射免疫3次,观察小鼠CD4+、CD8+T细胞亚群的变化,CFSE/PI双标记的流式细胞计数法检测CTL活性.结果:双酶切分析结果为目的基因(2.7 kb)和线性质粒pcDNA3(5.4 kb);PCR扩增结果为特异产物(2.7 kb);测序结果与GenBank gB基因序列同源性达99.5%;CTL活性增强;BALB/c小鼠脾CD4+T细胞增加.结论:经鉴定证实了HSV-Ⅰ gB基因疫苗的构建;HSV-Ⅰ gB基因疫苗可以诱导较强的细胞免疫应答,应用于预防HSV-Ⅰ的感染具有良好的前景.
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单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B核酸疫苗对小鼠血液学指标的影响
目的 检测单纯疱疹病毒I型糖蛋白B核酸疫苗(pcDNA3-gB)对小鼠血液生理学和血液生化学指标的影响,探索其安全性及实用性.方法 将不同浓度pcDNA3-gB(1 mg/ml、3 mg/ml、5mg/ml)通过肌肉注射免疫健康小鼠,对照组使用等量生理盐水,每10天免疫一次,共3次.末次免疫后24 h,检测各组小鼠9项血常规指标和9项血液生化学指标.结果 各组小鼠的全部血液生理、生化指标均较稳定,各试验组与对照组之间均无显著差异(P＞0.05).结论 不同剂量pcDNA3-gB免疫小鼠后,对小鼠的血液生理生化指标均无明显影响,初步证实了其安全性.
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单纯疱疹病毒I型糖蛋白B基因疫苗的初步免疫学研究
目的 利用构建成功的重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,探讨单纯疱疹病毒I型(HSV-Ⅰ)gB基因作为基因疫苗的可能性.方法 用重组真核表达质粒pgB免疫小鼠,通过中和试验、ELISA方法检测pgB接种小鼠的免疫效果,并对免疫的小鼠进行病毒攻击.结果 实验小鼠产生了对HSV-1特异性的抗体(抗体滴度:ELISA法1∶273,中和试验法:1∶49),实验组中和效价显著高于载体对照组和阴性对照组(P＜0.01);对病毒的攻击并有免疫保护作用,实验组和空白对照组比较(P＜0.01).结论 证明pgB真核表达质粒,具有DNA疫苗作用,可在小鼠体内诱发保护性免疫反应,pgB有可能作为基因疫苗用于单纯疱疹病毒性角膜炎预防和治疗,为进一步构建单纯疱疹病毒糖蛋白联合疫苗并终用于单疱病毒角膜炎奠定了理论基础.
关键词： 单纯疱疹病毒性角膜炎 糖蛋白B 基因疫苗 -
HSV-1糖蛋白B基因疫苗体内表达的观察
目的 利用单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白B基因疫苗(pgB)免疫小鼠,观察pgB在小鼠体内的表达.方法 利用pgB肌肉接种方法免疫小鼠,通过免疫组化法检测免疫后2、4、6 w pgB在眼、三叉神经、脑表达HSV-1 gB情况.结果 免疫后第2、4、6 w均可见视网膜、三叉神经节、脑组织中大部分细胞核呈棕黄色,免疫组化呈阳性.结论 经肌肉免疫pgB能持续、稳定地在视网膜、三叉神经节、脑组织细胞中表达.
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单纯疱疹病毒1型糖蛋白B基因疫苗的构建
目的:构建用于治疗和预防单纯疱疹病毒性角膜炎的核酸疫苗,探讨单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(HSV-1gpB)基因作为基因疫苗的可能性.方法:利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列(39 bp)的基因片断(2 673 bp),定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA-gpB,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定.结果:双酶切重组质粒pcDNA-gpB,电泳可见两条带,分别为目的基因(2 700 bp)和线性质粒pcDNA3(5 400 bp);以重组质粒pcDNA-gpB为模板进行PCR扩增,在2 700 bp位置扩增出特异的产物;测序结果表明,克隆基因插入方向正确,与GenBank中登录的HSV-1 F株gpB基因序列比较,同源性达99.5%.结论:利用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列(39 bp)的基因片断(2 673 bp),成功地构建了HSV-1基因疫苗pcDNA-gpB.
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单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B核酸疫苗安全性的初步评价
目的:通过检测免疫小鼠的血液生理学、血液生化学指标,以及8个重要组织器官的病理学,初步评估单纯疱疹病毒I型糖蛋白B核酸疫苗(pcDNA3-gB)的安全性.方法:将24只昆明种小鼠随机分为对照组、100、300和500 mg·L-1组,每组6只.各组分别于小鼠股四头肌肌肉注射1mL生理盐水、100,300和500 mg·L-1 pcDNA3-gB.末次免疫10 d后,进行血液生理学、血液生化学、肝、肾、心、脑、脾、角膜、视网膜、三叉神经节的病理学检查.结果:各组小鼠均存活,且血红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(HB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板记数(PLT)、白细胞计数(WBC)、红细胞体积分布宽度(RDW)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酯酶(ALP)、总胆红素(T-BIL)、尿素(BUN)、肌肝(Cr)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)及组织病理学与对照组比较差异均无显著性(P>0.05).结论:不同剂量pcDNA3 gB免疫小鼠后,对小鼠的生命、血液生理学、血液生化学、组织病理学指标均无明显影响,初步说明pcDNA3gB是安全的.
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单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白B基因疫苗对HSV-1原发及潜伏感染的抑制作用
目的 观察单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)糖蛋白B基因疫苗(pgB)在防治HSV-1原发及潜伏感染的作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为4组:A组(实验组,注射含质粒pgB的PBS)、B组(阳性对照组,注射灭活的HSV-1病毒液)、C组(载体对照组,注射含质粒pcDNA3的PBS)和D组(空白对照组,注射PBS).各组小鼠均于双侧股四头肌多点注射,共免疫3次,间隔3周.于末次免疫3周后行角膜划痕接种HSV-1.术后1～ 14、21和28 d行角膜荧光素染色,在裂隙灯显微镜下观察角膜炎病变形成情况.角膜接种病毒第30天,处死全部小鼠,取三叉神经节,接种Vero细胞,观察病毒潜伏感染形成情况.结果 A组和B组小鼠接种HSV-1后仅有轻度角膜上皮炎发生,且6d内全部愈合,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组和D组小鼠接种后第2天角膜上皮炎达到高峰,7d后炎症慢慢消失,与A组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).A组和B组小鼠接种后未发生角膜基质炎,且无1例死亡;C组和D组小鼠在接种后第5天出现炎症反应,并逐渐加重,接种后11～14 d角膜基质炎达到高峰,在接种后第30天有30％小鼠死亡.Vero细胞检测病毒潜伏感染,A组和B组未发生细胞病变,而C组和D组第5天发生细胞病变.结论 pgB能有效预防实验小鼠HSV-1原发感染,并抑制潜伏感染的形成.
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单纯疱疹病毒1型糖蛋白B胞外区基因片段的克隆、表达及初步鉴定
构建单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(HSV1gB)胞外区基因片段的重组原核表达质粒,并获得HSV1gB胞外区基因的表达.选用真核和原核细胞均偏爱的密码子,化学合成含信号肽序列的HSV1gB蛋白胞外区基因序列,用PCR方法扩增编码HSV1gB胞外区1～696 aa的基因,利用DNA重组技术将其定向插入到原核表达载体pGEX4T-2上,转化大肠杆菌TG1菌株,经IPTG诱导表达及SDS-PAGE鉴定分析.SDS-PAGE检测显示,表达的HSV1gB/GST 融合蛋白分子质量为96 ku.利用亲和层析方法,纯化获得了表达的目的蛋白.ELISA结果表明表达产物具有较好的抗原性和特异性.可溶性重组HSV1gB蛋白的表达成功为单纯疱疹病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础.
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婴幼儿人巨细胞病毒感染的临床表现和糖蛋白B基因分型
目的:了解婴幼儿人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染的不同临床表现,以及和不同糖蛋白B(gB)基因型HCMV的关系.方法:ELISA法HCMV-lgM检测确定的HCMV阳性的婴幼儿51例,对其不同临床症状进行分析.其中43例患儿,使用套式PCR(nPCR)法加限制性长度多态性分析(RFLP)进行HCMV gB 基因分型.结果:在51例HCMV感染患儿中全身性感染和单脏器感染分别占25.49％和74.51％,HCMV包涵体病和肝炎分别以25.49％和21.57％占较大比例.43例患儿HCMV gB基因的分型结果为,gB Ⅰ型20例,gBⅡ型9例,gBⅢ型7例,gBⅠ、Ⅱ混合型4例,gBⅠ、Ⅲ混合型2例,gB Ⅰ、Ⅲ混合型1例,未发现gB Ⅳ型.gBⅠ型占多数(47.83％).结论:婴幼儿HCMV感染临床表现种类多样；HCMV感染者以gBⅠ型HCMV占多数.
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鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与免疫试验
本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB,质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性.为测定该DNA疫苗的免疫效果,将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫,然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应.结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答.其中以pcDNA-gB/rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果好,其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多.上述研究结果为ILTV 新型疫苗的研究奠定了基础.
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造血干细胞移植术后人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB抗原血症及gB特异性CD8+T细胞测定
目的探讨HCMV gB抗原血症在HCMV感染中的诊断价值以及gB诱导的特异性CD8+T细胞在控制病毒激活中的作用。方法根据移植术后时间进行分组，免疫组化法检测92份异基因造血干细胞移植术后白细胞样本中的gB、IE和pp65抗原，分析gB抗原检测在监测HCMV感染中的意义。应用SYFPEITHI和REVEALTM主要组织相容性抗原-肽结合力测定筛选出潜在T细胞表位，进而合成MHC-肽五聚体，应用基于流式细胞术的五聚体染色分析筛选出gB相对优势表位。结果 HCMV gB抗原与pp65和IE抗原检测均呈正相关，其阳性率（82.6%）和pp65抗原阳性率（90.2%）差异无显著意义（P=0.065），但比IE抗原阳性率（92.4%）低（P=0.035）。三种抗原检测阳性率在移植术后1年内无显著差异；而在移植术1年后，gB阳性率低于IE和pp65阳性率（P=0.005），并且在gB阴性而IE或pp65阳性的标本中， IE或pp65阳性值处于一个较低的范围（1~6/5×104 WBC）。gB332-340可能是CD8+T细胞的免疫优势靶位，其诱导的gB特异性CD8+T细胞与gB抗原血症的发生呈现负相关。结论 HCMV gB对移植术后早期诊断感染有潜在的价值，并可能是一个提示病毒感染能力的指标；在对长期随访病人HCMV感染的监测中， gB与pp65、IE正相关，或许成为诊断HCMV感染的重要补充；gB特异性CD8+T细胞的免疫应答在控制HCMV感染中可能起到重要作用。
关键词： 人巨细胞病毒 异基因造血干细胞移植 糖蛋白B CD8+T细胞 -
慢性重型乙型肝炎患者人巨细胞病毒感染及特性分析
目的 研究慢性重型乙型肝炎(chronic severe hepatitis B,CSH)患者人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染特征及基因型分布情况.方法 对2011年4月至2012年12月西南医院感染科住院并诊断为慢性重型乙型肝炎患者132例进行血清HCMV抗体检测,巢式PCR法扩增外周血HCMV DNA(gB基因片段).HCMV IgM或DNA任一阳性定义为HCMV活化,依据结果分为无HCMV活化组(122例)和HCMV活化组(10例),分析2组患者临床特征、gB基因型并构建序列进化树.结果 ①患者HCMV IgG及IgM阳性率分别为100％与3.78％.2组AFP中位值分别为101.75和27.19,差异有统计学意义(P =0.024),其余实验室检查指标差异无统计学意义.无HCMV活化组,男女比例为7.7∶1,死亡2例,前者死于严重的并发症和多种病原体混合感染,后者死于多种并发症和心力衰竭；HCMV活化组(10例),男女比例为4∶1,无死亡病例,其自发性腹膜炎、腹水、肝性脑病、肝肾综合征比率均比无HCMV活化组高；②2组患者MELD评分无显著性差异(P =0.783),无HCMV活化组AFP水平显著高于HCMV活化组(P＜0.05)；③HCMV DNA阳性率5.3％(7/132),其中gB1型占85.71％ (6/7),gB3型占14.29％(1/7),未检测到gB2型和gB4型.HCMV IgM和DNA均阳性2例.结论 CSH患者HCMV DNA检出率高于血清IgM检出率,HCMV基因型以gB1型为主,存在较低比例的HCMV活化,CSH患者发生HCMV活化可能会影响疾病的转归.
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巨细胞病毒包膜糖蛋白B的研究进展
人巨细胞病毒是致人类先天畸形的重要病原体之一,其包膜糖蛋白B(gB)在病毒感染及诱导机体免疫反应中起重要作用,对其结构和功能的深入研究有助于进一步明确HCMV的致病机理,为治疗和免疫预防提供新路径.本文对近年来HCMV gB的结构,功能及其与HCMV感染的关系等方面的资料进行了综述.
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单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞浆区编码基因的原核表达、纯化及抗体制备
目的获得高纯度的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)糖蛋白B(gB)胞浆区蛋白并制备其特异性抗体.方法从感染HSV-1的BHK细胞中,提取总RNA,用RT-PCR特异性扩增HSV-1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆入表达载体pGEX4T-1中,进行融合表达.以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗体,进行Western b1ot鉴定.结果用IPTG诱导后,表达出相对分子质量(Mr)约42 000的融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗体滴度为1:400.结论获得重组HSV-1 gB胞浆区蛋白及其特异性抗体,为后续功能研究奠定了基础.
