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风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价
原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性.将RV衣壳蛋白C aa 3～29、aa 96～123以及包膜糖蛋白E1 aa208～247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别.分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgMELISA血清学检测中.
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柱上切除GST标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白
目的 表达幽门螺杆菌Lpp20 - GST融合蛋白,获取切除GST标签的重组蛋白.方法 采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组表达质粒Lpp20/pGEX - 4T -1在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,收集菌体并采用反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌3种细胞破碎方法,表达产物在谷胱甘肽琼脂糖树脂4B柱上纯化,利用凝血酶切除GST标签,用鼠抗Lpp20单克隆抗体进行纯化产物western blot鉴定.结果 高效表达出Lpp20 - GST融合蛋白,相对分子质量约为4.5 kDa,产物以部分可溶性形式表达,凝血酶成功切除GST标签,纯化产物能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别.结论 凝血酶柱上切除GST标签获得目的蛋白.
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野生型和失活型PAK1基因自我抑制域的GST标签真核表达载体的构建及表达
目的:构建不同活性的人p21活化激酶1(hPAK1)自我抑制域(AID)谷胱甘肽(GST)标签真核表达载体并鉴定其融合蛋白表达,以探讨PAK1 AID的功能及肿瘤治疗的靶向意义.方法:以pcDNA3.1 HisC-PAK1全长质粒为模板,利用PCR扩增野生型(WT) PAK1 AID片段,再以此片段为模板采用大引物法扩增其突变体L107F片段,双酶切克隆至GST融合的真核表达载体pEBG.将质粒转染至工具细胞HEK293中,并经免疫印迹鉴定GST融合蛋白的表达.结果:PCR扩增出约200 bp大小的野生型和失活型PAK1 AID片段,双酶切得到与预期大小相符的载体与PAK1 AID片段,野生型与失活型pEBG-PAK1在工具细胞HEK293中表达,蛋白的相对分子质量均为33 000.结论:成功构建野生型和失活型PAK1基因AID的GST标签真核表达载体,并表达出不同活性的GST-PAK1 AID的融合蛋白.
关键词： p21活化激酶1 自我抑制域 失活型(L107F) 真核表达 GST标签 -
结核分枝杆菌PZase-GST融合蛋白表达与鉴定
目的 构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌pncA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白.方法 PCR扩增结核杆菌pncA基因,并构建到pGEX4T-1上.重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白.结果 与预期大小相似,PCR扩增出大约600 bp的pncA基因,并且吡嗪酰胺酶(PZase)在诱导后得以高效表达.结论 构建了质粒载体pGEX4T-1-pncA,并经诱导后高效表达了PZase融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺(PZA)耐药性奠定了基础.
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幽门螺杆菌Catalas/GST融合蛋白的可溶性表达及凝血酶柱上切割GST标签
目的 利用GST融合基因表达系统表达幽门螺杆菌Catalase/GST融合蛋白,并利用凝血酶柱上切割GST标签.方法 将重组表达质粒Catalase/pGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态中并用IPTG进行诱导表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌进行裂解.采用谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B对Catalase/GST融合蛋白可溶性表达上清进行纯化,并同时利用凝血酶柱上切割GST标签,用鼠抗Catalase抗体对纯化产物进行Western blot鉴定.结果 高效表达出相对分子质量约85 kDa的Catalase/GST融合蛋白,以部分可溶性的形式表达,凝血酶柱上成功地切割了GST标签,Catalase蛋白能被鼠抗Catalase单克隆抗体识别.结论 成功表达了Catalase/GST融合蛋白并柱上切割了GST标签,为深入研究Catalase的功能奠定了基础.
