首页 > 文献资料
-
柱上切除GST标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白
目的 表达幽门螺杆菌Lpp20 - GST融合蛋白,获取切除GST标签的重组蛋白.方法 采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组表达质粒Lpp20/pGEX - 4T -1在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,收集菌体并采用反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌3种细胞破碎方法,表达产物在谷胱甘肽琼脂糖树脂4B柱上纯化,利用凝血酶切除GST标签,用鼠抗Lpp20单克隆抗体进行纯化产物western blot鉴定.结果 高效表达出Lpp20 - GST融合蛋白,相对分子质量约为4.5 kDa,产物以部分可溶性形式表达,凝血酶成功切除GST标签,纯化产物能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别.结论 凝血酶柱上切除GST标签获得目的蛋白.
-
利用生物信息学分析幽门螺杆菌Lpp20蛋的化学和免疫学分子特征
目的分析幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)郑州分离株MEL-HP27 Lpp20蛋白的主要化学和免疫学分子特征,为Hp基因工程疫苗和诊断抗原的研究奠定基础.方法根据本研究室克隆的Hp MEL-HP27 lpp20基因的核苷酸序列推导出该基因表达产物(Lpp20)的氨基酸序列,应用生物信息学软件Omiga2.0、Anthepro 4.5和GenBank数据库对Lpp20分子的主要化学特征和抗原活性进行分析.结果MEL-HP27 Lpp20蛋白的氨基酸序列长度为175aa,Lpp20蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,pH7.0时带电荷为9.035,280nm摩尔消光系数为12210,280nm吸光度为0.639,具有2个有抗原活性的结构域.结论MEL-HP27 Lpp20蛋白分子具有典型抗原分子的结构特征,有希望成为新的Hp疫苗候选抗原.
-
幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定
目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础. 方法 抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆人真核表达载体pcDNA3.1(+),转人大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定；用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1(+)- Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白. 结果 成功扩增出长约528bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与HpLpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆人真核表达载体pcDNA3.1(+),并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达. 结论 成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础.
-
幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定
目的 以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp2基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1(+)-Lpp20,为H. Pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础.方法 用Primer 5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori 26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1(+)-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体.结果 以H.pylori 26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H. Pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-Lpp20.结论 PCR扩增得到了大小约为528 bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1(+)-Lpp20真核表达重组载体.
-
幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的表达纯化及其临床应用的初步研究
目的 获得重组幽门螺杆菌(H.pylori)脂蛋白(rLpp20),并研究其在血清学诊断中的应用价值.方法 应用重组质粒pGEX-6P-2/Lpp20在大肠杆菌(E.coli)BL21中表达,并进行GST亲和层析纯化,用Western-blot检测纯化产物(rLpp20)的免疫反应性；以rLpp20为包被抗原建立EMSA法对200份患者血清标本进行特异性IgG抗体检测,并与幽门螺杆菌-IgG抗体检测试剂盒法进行比较.结果 成功表达的rLpp20(43 000 Mr),纯化产物可被幽门螺杆菌多克隆抗体及阳性血清识别；成功建立了以rLpp20为包被抗原的间接ELISA法,其灵敏度为91.0％,特异度为100％.与试剂盒法比较,两者的符合率为95.5％.结论 Lpp20具有良好的免疫反应性,能与幽门螺杆菌阳性血清特异性结合,有望应用于幽门螺杆菌血清学诊断.
-
幽门螺杆菌Lpp20抗原的原核表达及其临床应用
目的 获得原核重组表达的人幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)脂蛋白(lipoprotein20,Lpp20),并将其用于Hp感染的血清学检测.方法 应用PCR技术从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,先进行T-A克隆和测序,并与Genbank公布的其它Hp菌株基因序列比较,再将目的 基因克隆至表达载体pGEX-4T-1上,在E.coli TOP10中进行表达并进行GST-亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物Lpp20与Hp感染患者血清的反应,以Lpp20为包被抗原建立ELISA法对143份血样进行检测,并以试剂盒为参照.结果 扩增的Lpp20基因全长528 bp(GenBank登录号为DQ106902),与GebBank上公布的其它Hp菌株的序列相比较,核苷酸序列的同源性为96%～97%,推定氨基酸序列的同源性为98%～100%,表达的Lpp20融合蛋白分子量约为48 kDa,纯化产物可被Hp感染患者血清识别,以重组的Lpp20抗原建立的ELISA法检测Hp感染与试剂盒没有显著性差异.结论 重组Lpp20蛋白具有较好的抗原性,可用Hp感染的临床血清学检测及流行病学研究.
-
基于Mimox工具分析幽门螺杆菌Lpp20蛋白模拟表位
目的 利用Mimox软件分析幽门螺杆菌Lpp20蛋白模拟表位的性质.方法 将源于噬菌体随机肽库筛选技术获得的6个Lpp20模拟表位输入Mimox网站,参数设为默认值,进行模拟表位的比对,寻找其共同序列并分析其性质.结果 从ClustalW界面比对结果看,氨基酸D、A、S、G、L在模拟表位中出现的频率较高.通过统计学的方法推导出的共同序列为-[-W][PST][LDE]H[SDE][DM]ASG-[LT][YFW][-R]-,第2位置氨基酸W(50％),第7位置氨基酸D(67％),第8位置氨基酸A(50％),第9位置氨基酸S(50％),第12位置氨基酸L(50％)的出现频率较高.通过JalView界面推导出的共同序列为-WPLHSDASG-LYR-,保守性上第6位置S(分值6)、第7位置D(分值5)、第12位置L(分值5)比较高；特异性上第6位置S(分值2.067 059)、第12位置L(分值2.529 612)、第10位置G(分值1.805 491 4)、第3位置P(分值1.761 471 6)比较高；共同性上第7位置D(66％)、第8位置A(50％)、第9位置S(50％)、第10位置G(66％)比较高.结论 结合噬菌体筛选技术和生物信息学Mimox工具对抗原模拟表位进行分析并获得较全面的表位信息,为进一步确定抗原表位及研制新型表位疫苗奠定基础.
-
幽门螺杆菌Lpp20重组蛋白的表达、纯化及其免疫活性初步研究
目的 表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)脂蛋白Lpp20基因的重组蛋白,并检测其免疫活性.方法 应用PCR技术从H.pylori标准株26695染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段.将其克隆至表达载体pGEX-6P-2上,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21中表达并进行GST亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物重组Lpp20(recombinant Lpp20,rLpp20)的免疫反应性.免疫C57BL/6小鼠后,以rLpp20为包被抗原建立间接ELISA法对免疫小鼠血清进行特异性抗体检测;ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应等指标以分析rLpp20的免疫活性.结果 扩增的lpp20全长528 bp,与GenBank上公布的H.pylori 26695株lpp20序列作BLAST比较,结果完全一致;成功构建了pGEX-6P-2/Lpp20重组质粒,表达的rLpp20 Mr 43 000,纯化产物可被鼠抗H.pylori抗体识别;以rLpp20为包被抗原建立的间接ELISA法检测免疫小鼠血清,与对照组相比rLpp20免疫组可见阳性反应;rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL-2和IL-4含量均明显升高;脾淋巴细胞增殖反应测定,rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数也明显升高,与对照组有明显差异.结论 rLpp20具有良好的免疫活性,在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答,为筛选高效的H.pylori疫苗抗原奠定了基础.
