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霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达
目的 构建霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达.方法 用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxA上切下ctxA基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子pcDNA3.1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxA转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定.结果重组质粒pcDNA3.1-ctxA成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达,用Western blot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29 ku的蛋白.结论 成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxA,并在NIH3T3细胞中表达出29 ku的CTA蛋白.
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重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系.接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市.Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA63)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用.
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口服补液盐(ORS)在霍乱等腹泻病治疗上的作用
霍乱患者的主要症状是由于剧烈腹泻和呕吐,引起水及电解质丢失,迅速出现脱水和微循环障碍.霍乱肠毒素引起肠液的大量分泌,但肠道对葡萄糖的吸收能力并无改变,而葡萄糖的吸收还能增进水、钠的吸收.口服液体中电解质及浓度与血浆比较,大致是等渗的.
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滕州市致病性弧菌检测报告
报道了1995年以来,滕州市致病性弧菌种类、分布等病原学检测情况.共检疑似霍乱病人粪便1562人份,检出致病性弧菌127株,检出率为8.13%,其中非01群霍乱弧菌居首位83株占65.35%,其次为麦氏弧菌13株占10.4%,溶藻弧菌11株,河弧菌9株,副溶血弧菌6株,弗尼斯弧菌5株.83株非01群霍乱弧菌可分型者61株,分布8个血清型,定型率为73.49%,127株致病性弧菌产类霍乱肠毒素(G)47株占37.00%,以非01群霍乱弧菌产生类CT所占比例为高,从而说明它在毒力和致病性方面占有重要地位.
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霍乱弧菌肠毒素带毒情况分析
霍乱肠毒素(CT)是霍乱弧菌毒力因子之一,可分为A、B两个亚单位,这两个亚单位的基因ctxA和ctxB位于染色体上,并紧密相连.我们采用PCR法检测霍乱弧菌ctxA以测定其毒力,现将结果报告如下.
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霍乱的流行现状和防制
霍乱(cholera) 是急性肠道传染病, 自1817 年以来有过7次世界性大流行.Koch在1883年从病人粪便中首先发现其病原体--霍乱弧菌.发病机制主要是由霍乱肠毒素引起的分泌性腹泻.临床表现轻重不一, 一般以轻症多见.典型的临床表现为: 急性起病, 剧烈的腹泻、呕吐以及由此引起的脱水、电解质及酸碱失衡、循环衰竭[1,2].霍乱的流行目前在发展中国家仍是一个令人困扰的公共卫生问题.
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一株非产毒O139群霍乱弧菌的表型及基因型特性
2006年上海市从黄浦江水样中检测出一株霍乱肠毒素(CT)阴性的O139群霍乱弧菌,对其表型及基因型做了系统的鉴定,现将结果报道如下.
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067 霍乱肠毒素与霍乱丝状噬菌体有共同释放系统
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O139霍乱弧菌肠毒素核苷酸序列分析
目的 探讨O139霍乱弧菌肠毒素(CTX)核苷酸与O1群霍乱CTX毒素核苷酸序列异同.方法 用聚合酶链反应、DNA序列分析测定2株O139群、2株O1群古典型、2株O1群E1 Tor型霍乱弧菌CTX A2-B亚单位核苷酸.结果 2株O139群霍乱弧菌均含有CTX A2-B亚单位基因,O139群与O1群CTX A2-B核苷酸同源性为97.1%~98.9%.结论 O139群与O1群霍乱弧菌CTX A2-B核苷酸基本同源.进一步证实两者CTX核苷酸序列一致.
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ctxAB融合基因真核表达的初步研究
霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病.霍乱肠毒素(Cholera enterotoxin,CT)是引起霍乱的主要致病因子,是一种很强的免疫原和粘膜免疫佐剂,可用于研制粘膜免疫.
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产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系的临床应用前研究
目的:探讨产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系对临床模拟标本检测的意义,为该检测体系的临床应用提供可靠的技术依据.方法:将已知浓度霍乱弧菌灭活菌株悬液连续10倍稀释后与新鲜健康成人粪便混匀;制备成含菌量为5.0×101CFU/g~5.0×109 CFU/g梯度浓度的模拟带O1群霍乱弧菌者粪便标本和含菌量为5.0×101CFU/g~5.0×108CFU/g梯度浓度的模拟带O139群霍乱弧菌者粪便标本;用以评价我们自主建立的产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系对临床模拟标本检测的敏感度、特异性和稳定性.结果:该实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌或O139群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测敏感度均为1.0×103CFu每反应体系,亦相当于模拟带菌者粪便标本5.0×104CFU/g;对不同含菌量的模拟带菌者粪便标本的3次重复实验结果显示,各靶序列扩增反应Ct值的检测变异系数均小于5%;对新鲜健康成人粪便标本的检测未见明确的异常扩增.结论:我们建立的产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TraqMan聚合酶链反应检测体系可作为O1群或O139群产毒型霍乱弧菌临床粪便标本敏感、特异和稳定的检测手段.
关键词: 霍乱孤菌 Taqman聚合酶链反应 霍乱肠毒素 -
产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链反应检测体系的临床应用前研究
目的:探讨产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系对临床模拟标本检测的意义,为该检测体系的临床应用提供可靠的技术依据.方法:将O139群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0×1010 cfu(菌落形成单位)/ml]连续10倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0×1010~5.0×108 cfu/g梯度浓度的模拟带菌者粪便标本并提取DNA,用以评价我们自行建立的产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系对临床模拟标本检测的敏感度、特异性和稳定性.结果:实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对O139群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测敏感度为1.0×103 cfu每反应体系(5.0×104 cfu/g),其线性检测范围是1.0×103~1.0×107 cfu每反应体系;在稳定性评价中,对1.0×103~1.0×107 cfu模拟带菌者粪便标本DNA进行3次重复检测的结果显示,ctxA基因扩增反应Ct值的变异系数为1.40%~4.10%,rfb-O139基因扩增反应Ct值的变异系数为0.04%~2.08%;在特异性评价中,3名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见特异性扩增曲线.结论:我们建立的产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可用于O139群霍乱弧菌临床粪便标本的检测.
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产毒型O139群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系的建立
目的:建立针对O139群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系.方法:根据O139群霍乱弧菌主基因组O抗原编码基因rfb-O139和霍乱弧菌肠毒素A亚基的编码基因ctxA的特异性序列设计引物及探针,利用TaqMan标记探针和便携式Smartcycler Ⅱ荧光实时PCR检测平台探讨该检测体系的检测敏感性,用19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果:实时荧光双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系对O139群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0×102拷贝每反应体系;对O139群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度为1.0×102pg每反应体系;该检测体系在检测19种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时均不存在非特异性扩增;整个反应在2 h内完成.结论:本研究建立的实时荧光双重TaqMan聚合酶链反应检测体系可作为O139群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,并可同时检测O139群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.
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饮服行业从业人群非O1群霍乱弧菌带菌调查
非O1群霍乱弧菌广泛存在于外环境水体中,除O139群以外的有些菌株也可产生霍乱肠毒素,感染后引起人类腹泻,在感染性腹泻的病原学调查中,该菌的检出率可达5.13%[1].但在正常人群中该菌的带菌状况及该细菌的生物学特性却甚少见于报道,为了解该组细菌在正常人群中的分布及相关的特性,我们于1998~2002年的5年间共检测饮服行业从业人员体检粪便12217份,从中检出非O1群霍乱弧菌21株,并对其的型别、生物学特性、以及对抗菌药物的敏感性作了系统的检测,现将结果报告如下:
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两种PCR方法检测霍乱肠毒素的结果分析
目的:对两种PCR方法检测霍乱肠毒素(CT)的结果进行分析与比较.方法:利用普通PCR法和TaqMan荧光PCR法对霍乱弧菌的CT进行检测.结果:85株霍乱弧菌普通PCR法检测CT阳性19株,阴性66株;TaqMan荧光PCR法检测CT阳性20株,阴性65株.结论:普通PCR法和TaqMan荧光PCR法检测85株霍乱弧菌CT,只有1株前者阴性而后者阳性,其余84株的结果完全相符;DNA模板制备后普通PCR法检测CT需扩增、电泳和产物分析,4~5 h出结果,其过程繁琐;TaqMan荧光PCR法检测CT其操作方便简单,实现一管封闭反应,无需PCR后处理,结果直观,避免人为判断,1.5 h出结果,是一种更灵敏、准确和安全的CT快速检测法.
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3种检测霍乱肠毒素方法的比较研究
目的:对3种检测霍乱肠毒素(CT)方法的结果进行分析与比较.方法:利用PCR法、山梨醇发酵试验和CT平板测定法对霍乱弧菌的CT进行检测.结果:185株霍乱弧菌PCR法检测CT阳性92株,阴性93株;山梨醇发酵试验检测CT阳性92株,阴性93株;CT平板测定法检测CT阳性78株,阴性107株.结论:PCR法和山梨醇发酵试验检测霍乱弧菌CT的符合率为 100%;CT平板测定法只可用于检测O139群霍乱弧菌的CT;山梨醇发酵试验可用于检测霍乱弧菌的CT,其操作方便简单,检测CT快 5 h 出结果,是一种实用的CT快速检测法.
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编码霍乱肠毒素B亚单位基因植物表达载体的构建
目的构建含霍乱肠毒素B亚单位(CTB)基因的植物双元表达载体.方法采用高保真PCR方法调出CTB基因,定向克隆到中间载体pRTL2,经测序证实核酸序列正确后,再亚克隆到含植物双元表达载体pBI121上;采用电击法,将含CTB的植物表达载体转入根癌农杆菌中,并进行酶切证实.结果PCR扩增的CTB片断亚克隆到中间载体,得到pRCTB和pRCTBK,测序证实CTB核酸序列正确;再与根癌农杆菌双元载体pBI121连接,获得含CTB基因的植物双元表达载体pBI-CTB和pBI-CTBK,转入根癌农杆菌的载体,酶切证实正确.结论采用正确技术路线,构建了含CTB基因的植物表达载体,为下一步的转基因植物表达研究打下了坚实的基础.
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O139群霍乱弧菌16S rRNA基因分型分析
[目的]研究北京市O139群霍乱弧菌的分子生物学特征.[方法]对北京市1998~2000年的30株O139群霍乱弧菌进行PCR霍乱肠毒素(CT)基因检测,以16S rRNA为探针对菌株DNA进行Southern杂交后对图谱进行核糖体基因(RT)分型分析.[结果]对30株霍乱弧菌RT图谱进行分析,共存在5种16S rRNA核糖体基因型,其中CT阳性的O139群霍乱弧菌为RT1型,CT阴性的O139群霍乱弧菌为RT2-RT5型.[结论]北京市不同年份的O139群霍乱弧菌CT阳性菌株核糖体基因型较为单一,CT阴性菌株基因型具有明显的多样性.提示北京市O139群霍乱弧菌CT阳性菌株和CT阴性菌株遗传发生上相距较远.
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霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达
目的 构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DTA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达.方法 用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB.用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定.结果 真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号.结论 成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达.