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噬菌体裂解系统及其相关蛋白的研究进展
1896年,Hankin描述了一种可以限制霍乱流行、传播并有抗菌活性的物质-抗霍乱弧菌素,随后Gamaleya在枯草杆菌中发现了类似现象[1].噬菌体分别由Twort于1915年和Felix d'Herelle于1917年独立发现[2].噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的特异性病毒,即具有不同特性的、显示出长时期多种变异、适应和分化特征的超微生物.其中95%是双链DNA有尾噬菌体;其他少数噬菌体的颗粒大小、蛋白外壳和生活周期等差别很大.大多数噬菌体导致宿主细胞裂解,丝状噬菌体f1和M13等并不裂菌.噬菌体对其宿主的破坏作用很早就用于杀灭致病菌的研究.随着细菌耐药性的出现,对多种耐药性病原菌进行了很多探索性噬菌体治疗研究,现已有数百例关于噬菌体成功治疗人体感染的文献报道[3].噬菌体活体治疗存在很大的局限性,为寻找安全可靠的替代治疗方案,噬菌体裂解机制的研究越来越受到关注.
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T4噬菌体表面展示技术的研究进展
噬菌体表面展示技术(phage display)是由Smith于1985年首先建立起来的一种新的生物技术[1],它能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,保持相对独立的空间构象和原有的生物活性[2].常用的噬菌体表面展示系统主要有丝状噬菌体、λ噬菌体及T4噬菌体展示系统等.虽然它们都具有噬菌体展示系统的优点,但对于丝状噬菌体来说,它不能展示那些难以分泌的肽和蛋白质,而且它的N端可融合外源多肽的容量有限,较大蛋白的融合会造成空间障碍,影响噬菌体的装配,使其失去感染力.而对于λ噬菌体,大分子蛋白的融合会抑制噬菌体的组装,使其生长受到影响,因此这两种噬菌体更适用于构建短肽库和cDNA表达文库[3],而不适于构建重组疫苗和表达分子量大具有完整结构域的蛋白质[4,5].
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噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域的应用
1985年Smith率先将EcoRI内切酶的部分基因片段插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白基因Ⅲ区,使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面,并建立了噬菌体表面呈现技术(Phage display techniques).在此基础上,1990年Scott首次将编码随机序列肽的DNA与丝状噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ整合,使随机肽与噬菌体蛋白以融合形式表达,并呈现在噬菌体表面,从而建立了噬菌体随机肽库技术(Phage display random peptide libraries).近年来,噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具,在抗原表位(抗原决定簇)定位和模拟蛋白相互作用位点定位、功能配体或药物的筛选、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗上拓宽了研究者的思维,提供了新的途径.目前,该技术在寄生虫学领域同样受到研究者的青睐.本文就噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域中的应用作一综述.
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一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ
目的探讨介导霍乱弧菌毒素基因水平转移的一种独特的遗传结构. 方法从O139群霍乱弧菌菌株FJ97129上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ,并进行电镜观察.从丝状噬菌体颗粒CTAKΦ中纯化出DNA,并进行链型分析.对pCTAK进行酶谱分析.用ctxAB、zot引物对pCTAK进行PCR扩增检测,用RS1探针对pCTAK进行Southern blot检测;用pCTAK转化DH5α和IEM101得到DX29和4329,将pCTAK克隆于pUC18载体并转入DH5α得到UD29,用GM1-ELISA检测DX29、4329、UD29的CT表达.对pCTAK的ctxAB、zot基因片段进行测序,并用DNASTAR软件和BLAST算法,在国际互联网上对测序结果进行序列分析. 结果发现和分离了一种编码霍乱毒素的质粒pCTAK,它以稳定的高拷贝数存在于1株天然的O139霍乱弧菌FJ97129中;酶谱分析发现其明显不同于CTX元件酶谱,在CTX元件中相当保守的酶切位点:BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ、EcoRⅠ,在pCTAK中没有切点. ctxAB、zot引物对pCTAK的PCR扩增检测呈阳性,RS1探针杂交呈阳性;pCTAK的ctxAB、zot基因序列与已报道的序列有很高的同源性.pCTAK能直接或经载体转化DH5α和IEM101并表达CT.从FJ97129培养上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ,电镜观察并计算其直径大小为7nm左右.其全基因组大小为8.5kb,为单链DNA. 结论发现了一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ.
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O139霍乱弧菌CTAKΦ的基因水平转移的研究
目的探讨CTAKΦ介导的霍乱弧菌毒素基因水平转移. 方法用抗生素敏感试验筛选出几组基因水平转移试验组合的供、受体菌,以便于用抗性筛选来确定基因转移的情况.在这几组试验组合中分别用接合转移、上清水平转移、培养液水平转移的方法,检查供体菌将CTAKΦ的ARKR抗性转移给受体菌的能力. 结果供体菌FJ97129、DX29能通过多种转移方式,以很高的频率将CTAKΦ的ARKR抗性转移给受体菌HK42、XJ93172、GD3188、7763、569B和94001;而受体菌IEM101对CTAKΦ有一定的抗感染能力. 结论 CTAKΦ能够介导霍乱弧菌中霍乱毒素基因的水平转移.
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噬菌体展示技术的原理及应用
0引言1985年Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造,将EcoR Ⅰ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoR Ⅰ内切酶抗体所识别.1988年Parmley et al[2]将已知抗原决定族与pⅢ的N端融合呈现在表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.1990年McCafferty et al[3]也报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法,从而开始了这项技术的广泛应用的新时代.
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067 霍乱肠毒素与霍乱丝状噬菌体有共同释放系统
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丝状噬菌体展示技术在寄生虫学中的应用
本文介绍丝状噬菌体展示技术及其在寄生虫病预防、诊断和治疗中的应用.包括:①噬菌体展示技术概况,丝状噬菌体及其载体的优势;②构建寄生虫噬菌体抗体库、确定抗原决定簇、模拟抗原决定簇用于研制诊断试剂和疫苗等.
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噬菌体展示技术及其在弓形虫研究中的应用
将病原体的免疫原与λ噬菌体或其他病毒的衣壳蛋白融合后一起展示于病毒表面,这样形成的新的病毒颗粒可用作疫苗.Smith[1]通过基因工程手段将外源基因插入到丝状噬菌体的PⅢ蛋白基因中,成功地使外源多肽展示在噬菌体的表面,而且用抗体检测发现该外源多肽具有同天然产物相同的生物活性.这标志着噬菌体展示技术的诞生.而Geysen等[2]认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的功能位点,而且多数情况下,几个关键残基与其受体所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分.这就为噬菌体展示技术奠定了理论基础.
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噬菌体随机肽库技术的进展与应用
正由于Smith 率先在1985年将外源基因插入丝状噬菌体f1的外壳蛋白基因Ⅲ区,才使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面,从而建立了噬菌体表面呈现状技术[1].
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丝状噬菌体感染宿主早期的相互作用机制
自Twort和Herelle分别与1915和1917年各自独立发现噬菌体以来[1],对噬菌体及噬菌体-宿主相互作用的研究也越来越深入[2].噬菌体不仅在细菌基因水平转移的过程中发挥着重要的作用[2],而且,噬菌体治疗也有成功应用于临床人体感染的案例,这为解决细菌耐药性的问题提供了一条新思路[3].
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利用噬菌体载体展示抗体文库技术研究进展
1985年,美国Missouri大学的Smith GP将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage, fd)的基因组,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示,从而创建了噬菌体展示技术(1).
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噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
1985年,Smith GP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1].1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库.1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3].这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响.
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噬菌体呈现颗粒疫苗诱导抗肿瘤细胞毒性T细胞反应
目的构建呈现肿瘤相关抗原P815A的噬菌体颗粒,在体诱导针对肥大细胞瘤P815的特异性细胞毒性T细胞(CTL)反应.方法构建呈现CTL表位P1A35~43的噬菌粒载体,大量制备呈现此表位的重组噬菌体颗粒,小剂量、无佐剂皮下免疫DBA/2小鼠(H-2d),采用51Cr释放法、ELISPOT观察针对肥大细胞瘤P815的CTL反应.结果重组噬菌体呈现颗粒疫苗在体诱导了针对弱抗原P815A的CTL反应.结论丝状噬菌体呈现疫苗增强肿瘤相关抗原的免疫原性,是一种颇有潜力的抗肿瘤疫苗形式.
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噬菌体呈现疫苗诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T细胞反应
目的研究噬菌体呈现颗粒作为亚单位疫苗是否能在体诱导乙型肝炎特异性细胞毒性T细胞反应.方法构建呈现MHC I类分子(H-2d)限制性表位HBs28~39的噬菌体颗粒,小剂量、无佐剂接种BALB/c(H-2d)小鼠.结果重组噬菌体呈现颗粒在体诱导H-2d限制的HBs28~39特异性细胞毒性T细胞反应.结论丝状噬菌体呈现疫苗有效诱导细胞毒性T细胞反应,能用于发展抗病毒疫苗.
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丝状噬菌体随机呈现肽库的构建与鉴定
目的:构建一个随机20个氨基酸的丝状噬菌体肽库.方法:扩增随机合成DNA模板,经限制性内切酶XhoⅠ+SpeⅠ酶切后克隆进噬菌粒pTMB2,构建随机丝状噬菌体肽库并检验其库容及随机性.结果:完成丝状噬菌体随机肽库的构建,其库容为2.1×108,其氨基酸分布于理论频数无显著差异.结论:丝状噬菌体随机肽库被成功构建.
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噬菌体肽库技术与肿瘤的靶向治疗
噬菌体肽库是用基因工程手段在丝状噬菌体pⅢ基因的一侧插入特定长度的随机寡核苷酸,从而在噬菌体表面呈现与其次要外壳pⅢ融合的随机多肽,每一个噬菌体呈现一种序列的外源多肽,呈现特定长度的各种不同序列外源多肽的噬菌体集合体,即构成一个完整的肽库.其特点是:(1)融合蛋白不影响重组噬菌
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微生物基因组研究进展
微生物基因组研究与人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)是相得益彰的.由于微生物基因组相对较小,易于操作,它的研究往往先行一步,起到基因组研究中"先行官"的作用.早在人类基因组计划启动之前,Frank A等人(1980)就完成了花叶病毒基因组(8024 bp)的测序;Arrand JR等人(1981)完成了EB病毒的全基因组测序(172281 bp);Dunn JJ等人(1983)完成了T7噬菌体的基因组(39937 bp)测序;Peeters BP等人(1985)完成了大肠杆菌丝状噬菌体Ike的基因组(6883 bp)测序.在微生物基因组研究方面所取得的理论和技术进展,为人类基因组计划提供了极有益的借鉴.微生物基因组研究和人类基因组计划所用的策略是基本一致的.作为模式生物的微生物基因组(如大肠杆菌和酵母菌基因组)的研究本身就是人类基因组计划的研究内容.