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噬菌体呈现技术筛选抗黑色素瘤单链抗体
目的:制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段,用于肿瘤的诊断或靶向治疗.方法:从杂交瘤细胞提取总RNA,分别扩增出轻重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH和variable region of light chain,VLDNA),连接形成单链抗体(single chain fragment variable region,ScFv)DNA,将ScFv与载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1,经M13K07超感染后,获得噬菌体抗体ScFv cDNA文库,用黑色素瘤细胞LiBr对重组的噬菌体抗体进行3轮吸附-洗脱-扩增亲和筛选后,随机挑选克隆经ELISA筛选鉴定.结果:VH、VL和ScFv分别约为360、330、750bp,从随机筛检的30个克隆中获得10个高亲和性噬菌体呈现型ScFv单克隆.结论:用噬菌体呈现技术制备的黑色素瘤ScFv,可为肿瘤的诊断和靶向治疗奠定基础.
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噬菌体呈现的多聚多肽3A8诱导Jurkat细胞的凋亡效应
目的检测噬菌体呈现的多肽3A8诱导Fas+Jurkat细胞的凋亡效应.方法噬菌体表面呈现的多肽3A8与Fas+Jurkat细胞共孵育,通过Annexin-V检测细胞膜磷脂磷脂酰丝氨酸的翻转;流式细胞仪检测经处理的Jurkat细胞DNA含量;透射电镜观察细胞形态是否出现典型的凋亡特征.结果Annexin-V检测到经3A8处理的Jurkat细胞有32.64%的细胞膜磷脂磷脂酰丝氨酸发生了翻转.处理细胞经PI染色流式细胞仪分析,发现25.41%的Jurkat细胞发生凋亡,明显高于未经处理的对照组.透射电镜镜下观察到凋亡细胞不同时期的形态.结论噬菌体呈现的多肽3A8与Jurkat细胞结合,可诱导细胞凋亡.
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抗人结肠癌单抗MC5的功能性ScFv在大肠杆菌中的可溶性表达
目的制备抗人结肠癌单抗MC5的具功能活性的可溶性单链可变区片段(ScFv).方法从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体质量、轻链可变区基因(VH和VL DNA),经linker DNA连接形成ScFv DNA.将ScFv DNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,转化菌经辅助噬菌体M13KO7感染后,获得重组噬菌体.以高表达MC5结合抗原的人结肠癌细胞系SW480对重组噬菌体进行 2轮筛选后,经ELISA筛选呈现抗体ScFv片段的噬菌体单克隆.取2个强阳性克隆的噬菌体感染大肠杆菌HB2151,用于表达可溶性ScFv.经点印迹和Western印迹对可溶性ScFv进行鉴定,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性.结竦玫腣H、VL和ScFv DNA分别约为340、320和750 bp.对重组噬菌体经2轮亲和筛选后,经ELISA从25个克隆中筛检出10个抗原阳性克隆.源于2个强阳性克隆的可溶性ScFv的分子质量为32 000 u,且浓集于细菌周质腔中,可溶性ScFv具有抗原结合活性,其结合位点与亲本单抗MC5相同.结论针对MC5的具功能活性的可溶性ScFv的成功制备,为人结肠癌的体外(乃至体内)研究提供了新的靶向载体分子.
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噬菌体随机肽库的应用
生物大分子间的相互作用是一切生命现象的基础.近年来,噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具,在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制、以及药物的开发等领域具有广泛应用前景.本综述旨在介绍它在几个方面的重要应用.
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噬菌体肽库技术与肿瘤的靶向治疗
噬菌体肽库是用基因工程手段在丝状噬菌体pⅢ基因的一侧插入特定长度的随机寡核苷酸,从而在噬菌体表面呈现与其次要外壳pⅢ融合的随机多肽,每一个噬菌体呈现一种序列的外源多肽,呈现特定长度的各种不同序列外源多肽的噬菌体集合体,即构成一个完整的肽库.其特点是:(1)融合蛋白不影响重组噬菌
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胃癌特异性血管结合多肽的体内筛选和初步鉴定
目的:利用噬菌体随机肽库,体内筛选可与胃癌移植瘤血管内皮细胞特异结合的多肽片段,为肿瘤的血管抑制治疗提供有效的方法和手段.方法:采用肾包膜下移植法(SRCA),建立免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型.在小鼠体内对噬菌体十二肽库进行4轮淘筛,回收移植瘤和对照组织(脑)中的噬菌体并滴定计数.同时,用免疫组织化学染色法,检测噬菌体在移植瘤组织中的分布情况.结果:与胃癌移植瘤血管特异结合的噬菌体得到富集,为对照组织(脑)的3.4倍.随机挑取单个克隆测序鉴定,发现十二肽YESIRIGVAPSQ的出现次数多,免疫组化染色显示,噬菌体注入小鼠尾静脉5 min 后,定位于移植瘤血管的内皮细胞.向小鼠体内单独注入呈现十二肽YESIRIGVAPSQ的噬菌体,从胃癌移植瘤组织回收的噬菌体数量为对照组织(脑)的4.2倍,肺的4.9倍,心脏的5.4倍.结论:筛选到的模拟短肽YESIRIGVAPSQ,有可能成为肿瘤血管靶向治疗的有效工具.体内淘筛噬菌体随机肽库,筛选与靶器官血管内皮细胞特异结合的短肽是可行的,具有推广和应用价值.
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内皮素1在噬菌体表面的呈现及检测
目的使内皮素1(endothlin 1,ET1)在噬菌体表面呈现,尝试制备ET1抗体疫苗,治疗ET1病理性疾病.方法利用噬菌体呈现技术,经辅助噬菌体超感染以得到大量的ET1重组噬菌体粒子,并利用酶联免疫吸附测定和点杂交检测重组噬菌体粒子的免疫反应性.结果制备的ET1重组噬菌体的滴度可达4×1016CFU/ml, ET1重组噬菌体粒子具有ET1的免疫反应性.结论研究ET1基因在噬菌体表面的呈现, 不仅可以分析ET1与其他蛋白质之间的相互作用,受体识别位点的结构及其空间结构的关系, 更为重要的是可以进行ET1重组噬菌体疫苗研制的尝试.
