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噬菌体展示体内筛选技术及其应用进展
噬菌体展示技术是将高度多样性的多肽或蛋白展示于噬菌体衣壳蛋白表面的一项技术.这一技术将展示分子的基因型和表型联系在一起,极大地方便了多肽或蛋白分子的功能性筛选.从噬菌体展示文库中筛选出的多肽或蛋白具有高度的特异性和极强的亲和力,在生物医学基础研究和临床诊断治疗中具有重要的应用价值.随着噬菌体展示技术的不断发展,已将其用于活体的体内筛选.体内筛选技术发挥了高通量筛选的特点,能够在活体水平研究血管表面的分子表达状况,分析不同器官血管表面分子的表达差异,从而为临床靶向性诊断和治疗提供实验依据.
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津白Ⅱ小鼠体内筛选乳腺癌特异性结合噬菌体融合肽
目的:利用噬菌体随机肽库,筛选特异性靶向乳腺癌的肽段,为乳腺癌的定位诊断和靶向治疗提供理论依据.方法:建立津白Ⅱ(TAⅡ)小鼠自发乳腺癌模型,并在小鼠体内对噬菌体十二随机肽库进行4轮筛选,回收肿瘤和对照组织(肝)的噬菌体并计数,同时用免疫组织化学染色法,鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果:筛选出自发乳腺癌特异性结合的噬菌体,其结合乳腺癌细胞的能力为对照组织的14倍,随机挑选克隆测序鉴定.结果表明十二肽ASANPFPTKALL出现次数多,免疫组化染色进一步证明该噬菌体能特异结合于乳腺癌细胞.结论:4次小鼠体内筛选得到的短肽ASANPFPTKALL能够特异结合于乳腺癌组织,为下一步的定位诊断和靶向治疗研究奠定了基础.
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肿瘤特异单链抗体库的构建及肿瘤血管特异性结合抗体的体内筛选
目的:构建肿瘤组织特异的噬菌体呈现型单链抗体库,用噬菌体体内筛选与肿瘤血管特异性结合的单链抗体,为癌症的诊断和治疗奠定基础.方法:取食道癌、胃癌、脑癌、肺癌、脊髓瘤患者肿瘤组织,提取各肿瘤组织膜蛋白混合后免疫BALB/c小鼠,取鼠脾脏淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1,在辅助噬菌体M13KO7的作用下,获得重组噬菌体单链抗体库.以人宫颈癌HeLa细胞致瘤裸鼠为实验模型,用所构建的单链抗体库进行了4轮特异抗体的体内筛选.挑取了24个PCR鉴定为阳性的单链抗体做免疫组化分析,将在HeLa致瘤的组织切片上呈阳性染色、而在对照的肾组织切片上没有阳性染色的单链抗体进行序列测定.结果:选用7株不同的肿瘤细胞系建立裸鼠致瘤模型,以HeLa细胞致瘤裸鼠成瘤效果好.用所构建的库容量为1.6×106的单链抗体库对肿瘤血管特异结合抗体进行体内筛选,得到1株单链抗体ScFv(VH-linker-VL),命名为ScFvH1.结论:成功构建肿瘤特异单链抗体库,并用此抗体库筛选到与肿瘤血管结合特异性较好的单链抗体,为肿瘤的早期诊断和治疗提供了一条新的技术路线.
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人肺癌高转移动物模型的筛选及其细胞系的建立
目的:建立人肺癌小鼠高转移模型及高转移细胞系,同时观察相关生物学特性,为肺癌转移机制和防治等研究提供有用的实验工具.方法:切除首代小鼠移植瘤,以延长动物生存时间而获得转移灶,从第二代起采用肺转移灶→皮下移植→肺转移灶→皮下移植的体内循环筛选方法建立NOD/SCID小鼠人肺癌细胞SPC-A-1皮下移植瘤高转移模型,并进行肿瘤的生长和转移情况、组织病理学观察,同时建立相应的高转移细胞系,进行各种相关生物学特性观察.结果:第一代移植瘤切除后转移率达66.7%,通过4代体内反复筛选建立了100%肺转移NOD/SCID小鼠模型及相应高转移细胞系,细胞生长行为和染色体分析等生物学特性观察表明该细胞系保持了原有的人肺腺癌的生物学特性.结论:应用体内筛选的方法成功建立了人肺癌皮下移植瘤高转移模型及高转移细胞系,为肺癌防治研究及抗转移实验治疗提供了理想的动物模型.
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广谱趋化作用抑制剂的体内筛选及其活性鉴定
目的 为抗炎药物的研发提供先导肽.方法 利用脂多糖(LPS)刺激SD大鼠建立炎症模型,应用噬菌体展示技术经大鼠体内筛选得到阳性噬菌体克隆,经体内回输实验、趋化抑制实验和竞争结合实验鉴定噬菌体克隆的活性,提取生物活性较好的10个阳性噬菌体克隆的DNA进行测序,据此推导插入的氨基酸序列.结果 经过三轮体内筛选,目的 噬菌体得到了有效富集.对10个趋化抑制效果较好的阳性噬菌体进行测序,共得到5个序列,其中有2个序列出现的频率均为30%.结论 利用噬菌体展示技术体内筛选方法得到了抑制趋化作用的相关肽;该相关肽可作为抗炎药物的先导肽.
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原研药与仿制品质量差异对患者的影响
从研发的角度,药物可以简单的分为原创新药、Me Too药和仿制药.原创新药的研发是一个极其复杂的过程,从开发至上市需经过高通量筛选、理化特性研究、体外筛选、体内筛选等临床前研究;Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床研究;在此基础上经注册后方能上市.
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体内筛选骨肉瘤血管内皮特异性结合肽
体内噬菌体技术则将噬菌体展示技术与动物模型相结合,可以更好地进行肿瘤组织特异性结合肽的筛选.Pasqualini等~[1]和Wadih等~[2]利用该方法筛选出了特异结合脑和肾的噬菌体克隆,1997年他们成功筛选到一条恶性黑色素瘤及乳腺癌上整合蛋白的特异性亲和短肽,,把该肽与化疗药物耦联后进行动物实验,收到了很好的抗肿瘤效果.
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裸鼠原位种植人肝癌模型化疗指导临床用药研究
以手术为主的个体化综合治疗原发性肝癌(PLC)的策略已成为当今的共识[1],但化疗前患者对化疗药是否敏感报道尚少.我们在自己建立的人肝癌组织裸鼠原位种植模型上,进行了临床常用化疗药物的体内筛选.
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胃癌特异性血管结合多肽的体内筛选和初步鉴定
目的:利用噬菌体随机肽库,体内筛选可与胃癌移植瘤血管内皮细胞特异结合的多肽片段,为肿瘤的血管抑制治疗提供有效的方法和手段.方法:采用肾包膜下移植法(SRCA),建立免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型.在小鼠体内对噬菌体十二肽库进行4轮淘筛,回收移植瘤和对照组织(脑)中的噬菌体并滴定计数.同时,用免疫组织化学染色法,检测噬菌体在移植瘤组织中的分布情况.结果:与胃癌移植瘤血管特异结合的噬菌体得到富集,为对照组织(脑)的3.4倍.随机挑取单个克隆测序鉴定,发现十二肽YESIRIGVAPSQ的出现次数多,免疫组化染色显示,噬菌体注入小鼠尾静脉5 min 后,定位于移植瘤血管的内皮细胞.向小鼠体内单独注入呈现十二肽YESIRIGVAPSQ的噬菌体,从胃癌移植瘤组织回收的噬菌体数量为对照组织(脑)的4.2倍,肺的4.9倍,心脏的5.4倍.结论:筛选到的模拟短肽YESIRIGVAPSQ,有可能成为肿瘤血管靶向治疗的有效工具.体内淘筛噬菌体随机肽库,筛选与靶器官血管内皮细胞特异结合的短肽是可行的,具有推广和应用价值.
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人结肠癌血管特异结合短肽的噬菌体肽库筛选及鉴定
目的:通过建立小鼠肾包膜下荷人结肠癌模型、利用噬菌体肽库体内筛选技术,筛选并鉴定能够与人结肠癌血管内皮细胞特异结合的噬菌体呈现短肽.方法:制备免疫抑制小鼠肾包膜F人结肠癌移植瘤动物模型.将随机环七肽库通过尾静脉注入荷瘤鼠体内,回收归巢于肿瘤组织的噬菌体,进行4轮体内筛选,随机挑取20个克隆进行测序.细胞ELISA实验初步鉴定阳性噬菌体的内皮细胞结合能力.免疫细胞化学染色鉴定阳性噬菌体克隆与共培养内皮细胞的结合能力.免疫荧光技术检测短肽与共培养内皮细胞的特异性结合能力.结果:18个克隆测序正确,它们呈现2种氨基酸序列,命名为CV1及CV2,其呈现噬菌体称为pCV1及pCV2,其中CV2/pCV2重复次数多.细胞ELISA结果显示pCV2与Co-HUVECs(与结肠癌细胞共培养的人脐静脉内皮细胞)的结合明显高于HUVECs(人脐静脉内皮细胞),有显著的差异性结合,而pCV1在Co-HIJVECs,HUVECs上结合均较少,无差异性结合.免疫荧光染色结果显示,FITC-CV2特异性结合于Co-HUVECs的胞膜与核周胞质.结论:得到两个能特异件结合于结肠癌移植瘤的噬菌体单克隆pCV1及pCV2.pCV2具有特异结合结肠癌血管的能力,有可能用于结肠癌血管靶向治疗.
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抗肿瘤药物药效学的评价方法
抗肿瘤药物的药效学研究是新药发现与开发的重要环节，通常是指从样品到活性检测至动物实验的各个阶段的工作。本文介绍了抗肿瘤药物筛选的分子靶点及其抗肿瘤药物的药效学研究的体外筛选方法和体内治疗作用的动物试验方法，同时总结了抗肿瘤新药药效学评价中需关注的问题，展望了抗肿瘤药物药效学研究趋势。
