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结核分枝杆菌环七肽配体分子的筛选和鉴定
目的 基于噬菌体展示随机环七肽库,通过亲和筛选获得结核分枝杆菌(MTB)环七肽配体分子,初步鉴定其与分枝杆菌的结合能力,以优化纳米检测.方法 以MTB标准株H37Rv灭活菌体为靶分子,卡介苗(BCG)为反筛分子,对噬菌体展示随机环七肽文库进行筛选.4轮淘选后,挑选H37Rv和BCG洗脱单噬菌体进行测序,ELISA检测单噬菌体与其亲和力将高亲和力单噬菌体所展示环肽进行体外合成,并标记荧光,荧光显微镜与流式细胞仪检测合成环肽的结合活性,并与前期获得的线性结合肽进行比较.结果 经过4轮亲合淘选,能与靶分子结合的噬菌体明显富集.单噬菌体测序共获得16种共同序列.ELISA检测显示,单噬菌体SB1、SB5、SB8、SB26与H37Rv和BCG的亲和力均较高,其吸光度值(A450)与阴性对照吸光度值(A450)比≥2.1,与3种非分枝杆菌不结合,确定为阳性克隆.流式细胞仪检测结果显示,H37Rv与环肽SB1、SB5、SB24、SB26结合的阳性细胞率分别为(73.2±6.3)％、(63.2±5.3)％、(32.9±3.1)％、(89.4±7.0)％;BCG与这4种环肽结合的阳性细胞率分别为(65.6±6.1)％、(48.6±4.5)％、(10.3±1.8)％、(86.6±7.9)％,H37Rv和BCG与4种环肽结合的阳性细胞率均高于H8[(4.0±1.0)％、(5.5±1.2)％].荧光显微镜观察结果显示,环肽SB1、SB5、SB24、SB26荧光肽均与H37Rv发生结合,荧光强度较强,与其他18种分枝杆菌均有一定的亲和力,但荧光强度弱于H37Rv,与3种非分枝杆菌均不结合.结论 本研究以环七肽库替代线性七肽库,成功筛选获得新的MTB配体分子,其与分枝杆菌的亲和力提高.
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猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2中和表位的定位及其免疫反应性分析
猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.Ems和E2与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程.采用抗CSFV中和性单克隆抗体c24/10,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,结合噬菌体拟位免疫反应性分析结果,对CSFV E2蛋白中和表位进行定位.结果表明:E2蛋白的SPTTLR基序(832～837位氨基酸)构成CSFV特异性线性中和表位,基序的第一、二、三位氨基酸是表位与单克隆抗体c24/10结合所必需的氨基酸,也是表位的关键性氨基酸.
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人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选
目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标记的人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni2+-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍(第4轮与第1轮回收量分别为5.2×108、7.0×106 pfu),随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.
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结核分枝杆菌CFP-10/ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选
目的 探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白 10(CFP-10)/早期分泌抗原靶点 6(ESAT-6)融合蛋白 (CE 融合蛋白) 模拟抗原表位筛选中的应用.方法 以抗 CE 融合蛋白多克隆抗体为靶分子,对随机噬菌体 7 肽库进行筛选,经 3 轮生物淘选后,随机选取 18 个单噬菌体进行测序分析.采用双抗体夹心和竞争 ELISA 方法 对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定.采用间接ELISA 方法 ,选取阳性单噬菌体与 CE 融合蛋白分别对20 份活动性肺结核患者和 10 份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测.结果 经过 3 轮生物淘选,能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集.18 个单噬菌体测序共获得 9 种序列,其中单噬菌体 5、6、18 的氨基酸序列均包含 Trp-Asp-Ala-Thr (WDAT) 保守序列,该序列与 ESAT-6 第 58-61 位氨基酸的序列一致.9 种序列中各取 1 个单噬菌体经双抗体夹心和竞争 ELISA 检测,有 7 个单噬菌体 (1、5、6、10、13、14、18,S/N 值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0)确定为具有免疫活性的阳性克隆.选取含有 WDAT保守序列的阳性单噬菌体 5 与 CE 融合蛋白分别对 2 种血清标本抗体进行间接 ELISA 检测结果 显示,单噬菌体5 对 2 种血清标本抗体检测的吸光度值均高于 CE 融合蛋白(分别为0.931±0.298 vs 0.317±0.157、0.496±0.073vs 0.118±0.026,均P＜0.05);单噬菌体 5 对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率 (95%,19/20) 明显高于 CE融合蛋白 (60%,12/20),而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率 (9/10) 低于 CE 融合蛋白 (10/10).结论 利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出 7 个 CE融合蛋白的模拟抗原表位,并获得了定位于 ESAT-6 第 58～61 位氨基酸序列的 CE 融合蛋白的 1 个线性 B 细胞抗原表位,提高了 ELISA 检测的敏感性,为进一步研究 CE融合蛋白的其他抗原表位及以特异性抗原表位为基础开发结核抗体检测试剂奠定了基础.
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利用噬菌体随机肽库筛选表达Aβ靶向肽的噬菌体
目的 抗Aβ神经毒性的Aβ靶向肽噬菌体的筛选.方法 分别合成Aβ1-10序列组成的短肽并将其生物素化;以生物素化Aβ1-10为靶分子,用噬菌体展示技术及液相亲和捕获法筛选出特异性高亲和力的噬菌体;采用生物传感分析技术,通过结合特异性实验和短肽竞争性抑制实验,检测所筛选的噬菌体与靶分子之间的亲和动力学关系.结果 经过对靶分子Aβ1-10的3轮筛选,筛出了与Aβ1-10特异性结合的单克隆噬菌体;生物传感分析技术结果进一步表明,靶分子(Aβ1-10)与所筛选噬菌体之间的结合具有高度特异性.结论 筛选出了展示特异性高亲和力结合Aβ1-10短肽的噬菌体.
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人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究
目的 研制人源抗EV71病毒基因工程抗体.方法 采集多个患儿外周血淋巴细胞,构建人源抗EV71单链(scFv)噬菌体抗体基因文库.用纯化的EV71 VPI蛋白对抗体库进行筛选,将筛出抗体的轻链和重链通过序列测定确定抗体轻重链型别后分别克隆入全抗体表达载体pAC-LCH3R后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达.结果 成功地获得了1株抗EV71病毒VPI蛋白的人源单克隆抗体,利用ELISA、IFA对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,表达成分泌型IgG全抗体在体外与A型及C4亚型EV71病毒的中和反应结果 显示为阴性.结论 从免疫库中获得了1株人源非中和单抗,为EV71病毒引起的手足口病的鉴别诊断奠定了基础.
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应用噬菌体表面展示技术筛选流感病毒H3N2抗原模拟表位
目的 筛选特异性流感病毒H3N2抗原模拟表位,为开展新的流感病毒疫苗研究探索新的途径.方法 应用噬菌体表面展示技术,以抗-H3N2的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,在第5轮筛选后,随机挑取48个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定H3N2抗原的模拟表位.结果 经噬菌体富集后,从随机筛选的48个克隆中得到21个阳性克隆,经ELISA鉴定及交叉反应实验、竞争抑制性实验后,确定氨基酸序列XTXPYXX为H3N2的模拟表位.结论 用噬菌体7肽库筛选得到H3N2的模拟表位,为开展用流感病毒模拟表位探索新的防治方法研究奠定了基础.
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用噬菌体展示肽库技术筛选甲肝病毒抗原模拟表位
目的 用噬菌体展示肽库技术筛选甲型肝炎(甲肝)病毒抗原模拟表位,为病毒抗原决定簇定位探索可行方法.方法 用纯化的抗甲肝病毒单克隆抗体,对噬菌体展示12肽库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,随机挑取10个克隆,用酶联免疫吸附法(ELISA)对噬菌体克隆进行抗原性鉴定、竞争抑制鉴定及DNA序列测定分析,推导出展示肽氨基酸序列并与甲肝病毒(HAV)代表株结构蛋白氨基酸序列比较.结果 10个噬菌体克隆ELISA检测全为阳性,9个具有一致序列,与HAVHM175株结构蛋白中和活性表位之一:VP1 157-171区具有类似序列,另一株噬菌体克隆在HAVHM175中未发现类似序列,结果表明这些展示肽可能是HAV抗原模拟表位.结论 用噬菌体展示肽库技术筛选得到了HAV模拟表位,为开展病毒模拟表位研究打下了基础.
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鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库的构建和初步鉴定
目的 构建和鉴定鼠源抗haPrP23-231噬菌体抗体库.方法 利用纯化的朊蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取脾,提取细胞总RNA,逆转录cDNA,以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增,将轻链和重链Fd段基因分别构建到pComb3质粒,构建噬菌体抗体库.结果 经过四轮"吸附-洗脱-富集"的过程后获得了12株阳性克隆.挑取5株进行序列分析,并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较,得到了两株不同的抗体,并进行了初步鉴定.结论 本研究为朊病毒病的研究奠定了基础.
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金黄葡萄球菌agrC结合小肽的筛选及初步鉴定
金黄葡萄球菌(简称金葡菌)附属基因调节系统(accessory gene regulatory system,agr)是重要的毒力因子调节系统和生物被膜形成调控系统.金葡菌几乎所有的胞外和表面毒力因子都在agr的控制之下~([1]),asrC是该系统中重要的信号转导分子.本研究通过噬菌体展示技术,以agrC蛋白为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行筛选,寻找能与agrC特异结合的多肽,将其作为靶向治疗金葡菌感染的载体,为临床研究金葡菌生物被膜形成的机制和研制新型靶向药物提供实验依据.
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胃癌相关抗原模拟表位的筛选及鉴定
噬菌体表面呈现技术作为一种揭示蛋白质相互作用的快捷有效工具，已受到广泛重视，并在抗原表位的确定及多肽疫苗的设计中显示出优势〔1,2〕。噬菌体随机肽文库是基于上述技术而构建的。噬菌体其被认为是配体的“万能库”，这些配体不一定和天然配体完全相同，但能模拟天然配体与受体的结合特性。因此，在抗原表位-抗体的识别研究中，可以从肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位，这些表位既可以是线性表位，也可以是模拟的构象性表位。
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Survivin拮抗肽的筛选及鉴定
目的:筛选能与Survivin相结合的多肽,从中寻找拮抗剂,抑制Survivin的作用.方法:通过筛选噬菌体12肽库得到与Survivin相结合的多肽,以固相法合成这些多肽并用质谱仪进行鉴定;利用Wwestern blot和caspase-3活性检测从中筛选拮抗Survivin表达和功能的多肽.结果:用Survivin蛋白筛选噬菌体肽库,得到8条结合多肽;经体外实验验证,8条肽抑制Survivin蛋白的活性不一,其中3条有显著活性(P＜0.05);而且这3条多肽能够增强caspase-3的活性.结论:以噬菌体随机肽库法筛选获得了有抑制Survivin功能的拮抗肽,此结果为抗肿瘤肽类药物的研制奠定了基础.
关键词： 微管相关蛋白质类/拮抗剂和抑制剂 肽类/药理学 肽库 -
应用噬菌体随机肽库技术筛选缓慢进展者HIV-1中和抗体模拟表位
目的 以含有高水平HIV-1中和抗体的血浆为配体筛选HIV-1中和抗体模拟性抗原表位.方法 为获取中和抗体识别的模拟表位,采用多轮感染外周血单个核细胞( PBMC)中和实验检测11例HIV感染缓慢进展者血浆中和抗体水平,利用噬菌体随机肽库对具有高水平中和抗体的血浆进行生物淘筛,ELISA方法鉴定阳性克隆.阳性克隆测序后与HIV Env gp41序列进行了同源性分析,应用Local Blast软件分析中和抗体模拟表位.结果 3轮淘筛之后,得到22个阳性克隆.分析发现包括C8等12个可能的中和抗体模拟表位,位于gp41Ⅱ类功能区的C40对HIV-1血浆具有较高的抑制率.结论 利用缓慢进展者血浆IgG抗体筛选噬菌体随机肽库,能够有效的获得多个HIV-1中和抗体相关抗原模拟表位.
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噬菌体模拟抗原替代亲环素A在测定自身抗体中的应用
目的探讨噬菌体展示肽库来源的模拟抗原替代重组人亲环素A(rhCyPA)在测定自身免疫病人血清抗亲环素自身抗体中应用价值.方法以抗人亲环素A 单克隆抗体(McAb)D4和E6作捕获抗体对噬菌体展示肽库进行淘筛,通过序列测定推断出模拟抗原氨基酸序列.再以筛出的模拟抗原包被微孔板,与重组人亲环素A抗原进行对比,用ELISA法检测系统性红斑狼疮患者血清抗亲环素自身抗体.结果从12肽库淘筛出的10个噬菌体克隆中9个共有一致氨基酸序列HWEYTTSPHPRL.56例SLE患者血清用12肽模拟抗原的ELISA测定,CyPA自身抗体阳性率为50%(28/56),用rhCyPA作包被抗原测定阳性率为43%(24/56);两法检测34例其他自身免疫病的阳性率均为11%,两法结果符合率为95.6%.通过试验比较,12肽模拟抗原用于检测CyPA自身抗体优于重组抗原和7肽模拟抗原.结论用抗CyPA单克隆抗体从噬菌体展示肽库淘筛出的特异12肽能模拟亲环素A抗原表位信息,可以代替亲环素A用来检测其自身抗体.
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利用噬菌体随机肽库筛选强直性脊柱炎特异性血清标志物
,阴性预测值为100%,准确性为90%,且AS患者血清与AS1反应的A值与ESR、CRP之间为正相关关系(R2=0.165,P=0.448;R2=0.259,P=0.270).结论 用纯化的AS患者血清IgG从噬菌体随机12肽库中的筛选的阳性克隆AS1具有抗原性,能与AS患者血清特异性反应,可成为AS特异性血清标志物的候选分子之一.
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应用噬菌体展示技术筛选血型A抗原表位的模拟多肽
目的 筛选血型A抗原表位的模拟多肽,探讨其在血型A抗体检测中的应用价值.方法 用血型A抗原特异性单克隆抗体NaM87-1F6从噬菌体随机12肽库中筛选能与之结合的噬菌体展示肽.采用噬菌体ELISA、噬菌体微筛选试验鉴定噬菌体与抗体的结合力.DNA测定并推断特异性噬菌俸克隆展示的多肽序列.凝集抑制试验检测单克隆噬菌体对抗体凝集红细胞的抑制作用,ABO-ELISA初步分析噬菌体展示多肽检测血型抗体的效能.结果 经筛选和鉴定后得到7个阳性克隆,其中6个展示多肽序列为EYWYCGMNRTGC(C5),1个为QIWYERTLPFTF(C17).凝集抑制试验提示2个噬菌体展示多肽可以特异性抑制NaM87-1F6对A型红细胞的凝集作用.基于噬菌体多肽C5、C17的ABO-ELISA检测血浆抗A抗体试验的受试者操作特性曲线下面积分别为0.889(P=0.000)和O.751(P=0.000),ABO-ELISA值与凝集试验抗体滴度间的Spearman相关系数分别为0.743(P＜0.01)和0.664(P＜0.01).基于C5的ABO-ELISA在临界值为0.300时其敏感度、特异度分别为82.2%和83.3%;基于C17的ABO-ELISA在临界值为0.250时其敏感度、特异度分别为68.9%和63.3%.结论 多肽EYWYCGMNRTGC,QIWYERTLPFTF可以模拟血型A抗原的表位.基于这些多肽的ABO-ELISA方法具有检测血型A抗原特异性抗体的潜能.
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人Rh(D)血型抗原模拟表位的筛选和鉴定
目的 从噬菌体随机肽库中筛选人Rh(D)血型抗原模拟表位,并对其免疫学活性进行鉴定.方法 以抗Rh(D)单克隆抗体作为固相筛选分子,对噬菌体随机十二肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选35个克隆,经噬菌体ELISA和交叉反应试验,确定阳性克隆,再对这些克隆进行DNA序列测定和抗体竞争抑制试验,以获取人Rh(D)血型抗原模拟表位.然后采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)对所获噬菌体进行鉴定和抗原性分析.结果 经过3轮淘洗后,噬菌体得到富集,获得11个阳性克隆.DNA序列测定和竞争抑制实验结果表明,这11个克隆噬菌体所展示的外源多肽中有7个克隆氨基酸序列含有相同的色氨酸(W)、脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)结构(-WP-Q-),且均具有40%以上的抑制率;其余4个克隆没有共性,抑制率较低,可能为非特异性结合.Western blot分析表明,被选定的噬菌体能被抗Rh(D)血清特异识别,具有类似于Rh(D)蛋白的抗原性.结论 利用抗Rh(D)单克隆抗体筛选噬菌体随机肽库,成功获得含有(-WP-Q-)结构的Rh(D)抗原模拟表位,为进一步探讨Rh(D)新生儿溶血病的发病机制和疫苗的研究奠定基础.
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噬菌体随机十肽库的构建
目的采用丝状噬菌体表达载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十肽库.方法人工合成编码随机十肽的寡核苷酸片段及两条分别有SfiI和NotI酶切位点的引物,通过PCR反应得到其双链片段,将其克隆入载体pHEN1中,将重组产物转化入大肠杆菌TG1,构建成随机肽库.结果所建肽库含1×109个集落形成单位(cfu).随机挑取8个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机.结论成功构建了有较高库容量的噬菌体随机十肽库.
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利用噬菌体肽库筛选特异性哇巴因结合肽
目的寻找与哇巴因特异性结合的多肽,为实现阻断或拮抗哇巴因与钠泵的作用,减少EO致高血压作用奠定实验及理论基础.方法采用噬菌体随机肽库表面呈现技术筛选出哇巴因特异性结合肽,通过测序,获得氨基酸序列,进行同源性分析,合成筛选出的12肽,采用放射性配基受体结合法检测哇巴因结合肽与哇巴因的结合能力.结果从噬菌体12肽库中筛选出三种多肽,肽A(12肽)的筛选一致率达到66.7%(8/12);肽B(8肽,插入片段中出现终止子) 筛选一致率为16.7%(2/12);肽C(12肽)为8.3%(1/12);仅1例未见插入的多肽片段.Genbamk中蛋白质同源性分析结果:肽A、B、C均未见同源蛋白.结论哇巴因特异性结合肽蛋白质序列的获得,为哇巴因的研究提供了实验基础.
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应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒NS5A抗原模拟表位
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(HCVNS5-A)特异性噬菌体模拟表位,为抗HCV的疫苗研究探索新途径.方法:应用噬菌体表面展示技术,以抗-HCV NS5A的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,随机挑取30个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV NS5A抗原的模拟表位.结果:经噬菌体富集后,从随机筛选的30个克隆中得到12个阳性克隆,确定氨基酸序列XXXPXXXLLRXX为HCV NS5A的模拟表位.结论:用噬菌体12肽库成功筛选得到HCV NS5A的模拟表位,为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.
