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应用酵母双杂交系统筛选hTNFα特异性结合肽
肿瘤坏死因子(TNFα)是一种多功能细胞因子,目前已知许多病理性反应与之有关,如类风湿性关节炎、脓毒性休克、慢性心衰等[1].TNF的生物学功能是通过结合到细胞表面相应的受体(TNFR)来实现的,因此在炎症区引入可溶性TNF受体或TNF抗体,与膜上受体竞争性结合TNF,可以抑制TNF介导的生物学活性[2].在临床上,Enbrel、Infliximab和efalizumab等TNF拮抗剂,对类风湿性关节炎、节段性肠炎具有良好的治疗效果[3-5].
关键词： 肿瘤坏死因子(TNF) 酵母双杂交系统 结合肽 -
以特异性噬菌体展示肽为靶筛选TNF-α结合肽的研究
目的建立以特异性噬菌体展示肽为靶从噬菌体肽库中筛选结合表位的新方法. 方法以前期工作中筛选得到的模拟TNF-α表位的环七肽克隆LCS-7(c-RRPAQSG-c)为靶,筛选噬菌体线性十二肽库;用间接ELISA及竞争试验鉴定阳性克隆. 结果对噬菌体十二肽库进行3轮筛选后,挑取20个克隆中有10个为阳性克隆,测序结果氨基酸序列相同:EHMALTYPFRPP. 结论以TNF-α模拟肽克隆为靶筛选得到的噬菌体十二肽克隆,能够与TNF-α结合,为TNF-α结合肽;所测得序列完全一致.上述结果提示了该筛选方法的可行性.
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利用噬菌体肽库技术获得与人Fas结合的多肽基序
目的利用噬菌体随机肽库技术获得与人Fas胞外区结合的多肽及其多肽基序,观察多肽基序的生物学功能. 方法以人Fas胞外区与IgG Fc段的融合蛋白Fas.Fc为筛选配基,筛选噬菌体随机九肽库;微量淘洗与ELISA相结合鉴定阳性克隆,DNA测序和分析.化学合成多肽进行竞争性ELISA以及细胞增殖抑制实验. 结果经过4轮亲和筛选,微量淘洗鉴定,获得42个阳性克隆;固定ELISA实验显示筛选到的噬菌体短肽能与Fas.Fc特异性结合,并呈剂量依赖关系;随机选取13个阳性克隆进行DNA测序,其序列及出现几率分别为:PRKARVDTS(2/13)、YKKKSLQVQ(2/13)、YKKKSMLQA(2/13)、SRKKYDQYA(4/13)、YARKIKPTA(2/13)和ARKKTEGAG(1/13).经多重序列分析,获得多肽基序:*R/KKK****A.在ELISA和竞争性ELISA实验中,化学合成多肽EGEFYKKKSMLQADPAK (P3)可抑制Fas与抗人Fas单抗Apo-1的结合,且呈剂量效应关系;P3不能抑制Fas与FasL的结合.细胞增殖实验表明,多肽可抑制Jurkat细胞增殖,且随多肽剂量的增加而加强.多肽与单抗Apo-1联合作用对Jurkat细胞增殖的影响与单独使用P3没有明显差别. 结论通过噬菌体随机肽库技术获得与Fas结合的多肽及其多肽基序,它们可能模拟了抗Fas抗体Apo-1对Fas的结合位点,为基于Fas凋亡的多肽药物前体设计提供了实验依据和结构基础.
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利用噬菌体肽库筛选特异性哇巴因结合肽
目的寻找与哇巴因特异性结合的多肽,为实现阻断或拮抗哇巴因与钠泵的作用,减少EO致高血压作用奠定实验及理论基础.方法采用噬菌体随机肽库表面呈现技术筛选出哇巴因特异性结合肽,通过测序,获得氨基酸序列,进行同源性分析,合成筛选出的12肽,采用放射性配基受体结合法检测哇巴因结合肽与哇巴因的结合能力.结果从噬菌体12肽库中筛选出三种多肽,肽A(12肽)的筛选一致率达到66.7%(8/12);肽B(8肽,插入片段中出现终止子) 筛选一致率为16.7%(2/12);肽C(12肽)为8.3%(1/12);仅1例未见插入的多肽片段.Genbamk中蛋白质同源性分析结果:肽A、B、C均未见同源蛋白.结论哇巴因特异性结合肽蛋白质序列的获得,为哇巴因的研究提供了实验基础.
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RAP结合肽-hFcγ1融合蛋白的表达与初步活性鉴定
目的:将肽库筛选到的正调控金黄色葡萄球菌(金葡菌)外毒素分泌的关键分子RAP(RNA Ⅲ activating protein)的结合肽与人IgG1抗体Fc片段(hFcγ1)融合表达,检测其干扰金葡菌外分泌毒素产生的活性.方法:根据噬菌体肽库筛选到的RAP结合肽序列,选用大肠杆菌偏爱的密码子合成基因片段,将其融合在人IgG1抗体Fc片段基因序列的5′端,构建pET-rapbp-fc融合表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达.以包涵体形式存在的目的蛋白经变性、复性后,ELISA实验分别证实其与抗人IgG抗体及纯化RAP的结合活性.以MDBK细胞株为模型,MTT实验观察融合蛋白对金葡菌196菌株外分泌毒素水平的影响.结果与结论:融合基因在大肠杆菌中获得表达.复性后,融合蛋白的Fc片段及结合肽部分分别能够与抗人IgG抗体及RAP结合,且能在一定程度上降低金葡菌196株上清中的毒素水平.
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p185HER-2蛋白胞外区的表达及其结合肽的筛选
目的:构建p185HER-2蛋白胞外区的原核表达载体,实现p185HER-2蛋白胞外区的表达.以纯化p185HER-2蛋白胞外区为靶,从噬菌体肽库中筛选其结合肽,用于肿瘤导向治疗.方法:从含有HER-2全长cDNA的质粒psv2-cerbB-2中克隆了人p185HER-2蛋白胞外区cDNA,将此cDNA克隆到pET-30a+表达载体中,构建p185蛋白胞外区的表达载体.表达的p185HER-2蛋白胞外区通过Zn2+螯合层析柱进行纯化.以纯化的p185HER-2蛋白胞外区为靶,通过淘洗方法进行噬菌体肽库筛选.结果与结论:构建了p185HER-2蛋白胞外区的原核表达载体,实现了p185HER-2蛋白胞外区的高表达.通过Zn2+螯合层析柱实现一步纯化,p185HER-2蛋白胞外区的纯度达到95%.从噬菌体随机环七肽库中找到了一组具有核心序列p185HER-2蛋白胞外区结合肽.这些p185HER-2蛋白胞外区结合肽有可能成为肿瘤治疗的新的候选分子.
关键词： p185HER-2蛋白 包涵体 噬菌体肽库 结合肽 -
利用噬菌体肽库筛选Survivin结合肽
目的:将纯化的Survivin蛋白作为诱饵,从噬菌体肽库中筛选出结合肽.方法:用纯化的Sur-vivin蛋白包被35 mm的塑料培养皿,加入随机12肽的噬菌体肽库,用靶分子溶液竞争性洗脱结合的噬菌体.通过测定噬菌体滴度检测Survivin蛋白的吸附、富集效果,筛选阳性噬菌斑,制作DNA测序模板进行测序.结果:经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效果.从第3轮筛选产物中挑取8个蓝色噬菌斑(阳性克隆)进行测序,DNA测序结果表明,具有一致性序列GIANNFFTLKIS.结论:从噬菌体随机肽库中,筛选到能与Survivin蛋白特异性结合的一段短肽,为Survivin蛋白的进一步研究奠定基础.
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法氏囊活性肽-Ⅱ对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其可能机制
目的:研究法氏囊活性肽(Bursal-derived pentapeptide,BPP)-Ⅱ对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其可能的作用机制.方法:采用不同质量浓度(0.02、0.2、2、20 μg/ml)的BPP-Ⅱ分别处理小鼠B细胞淋巴瘤细胞WEHI-231、人鼻咽癌细胞CNE、大鼠肝癌细胞RH-35和正常细胞系人胚肾细胞293、猪肾细胞PK15、中国仓鼠卵巢细胞CHO,48 h后采用MTT法检测细胞增殖情况;以双荧光素酶报告系统和Western blotting方法检测BPP-Ⅱ对荧光素酶标记的p53-Luc质粒转染的Vero细胞中茚p53转录活性和P53蛋白表达的影响;利用噬菌体随机12肽库筛选BPP-Ⅱ特异性结合肽,人工合成BPP-Ⅱ结合肽,采用MTT法检测BPP-Ⅱ结合肽对BPP-Ⅱ抗WEHI-231细胞增殖能力的影响.结果:2和20 μg/ml的BPP-Ⅱ对肿瘤细胞WEHI-231、CNE、RH-35的增殖均有抑制作用(均P＜0.05),而对正常细胞系293、PK15、CHO的增殖均不表现出抑制作用.BPP-Ⅱ明显激活53基因的转录,并上调P53蛋白的表达.应用噬菌体展示技术筛选获得3个BPP-Ⅱ结合肽P3-12、P5-12、P6-12,其中2和20 μg/ml的P3-12能显著抑制BPP-Ⅱ的抗WEHI-231细胞增殖能力[(97.5±3.4)％、(98.9±3.5)％us(86.3±1.9)％,P ＜0.05];20 μg/rnl的P5-12和P6-12均能显著抑制BPP-Ⅱ的抗WEHI-231细胞增殖能力[(96.7±3.1)％、(95.4±3.8)％vs (86.3±1.9)％,P＜0.05].结论:BPP-Ⅱ可特异性抑制WEHI-231、CNE、RH-35等肿瘤细胞增殖,其机制可能与激动p53信号通路有关.
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应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽
目的:探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体.方法:以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白(MUC1/Yex)为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氨基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆与正常及肿瘤细胞的结合能力及特异性.结果:通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MUC1/Yex的结合中起重要作用.阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合.结论:筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究.
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从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽
目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽.方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆.结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列.结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径.
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结合肽抑制鸭乙型肝炎病毒复制作用的研究
目的:探讨与鸭乙型肝炎病毒多聚酶(DHBVP)特异结合的结合肽,对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的原代鸭肝细胞中DHBV复制的抑制作用.方法:应用噬菌体表面展示技术(PDT)筛选出与DHBVP特异结合的结合肽,经测序得知其核苷酸序列,推论出其氨基酸序列,据此合成结合肽,将其作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,分时段检测细胞核、细胞浆及培养上清中的DHBV-DNA.结果:应用噬菌体展示技术筛选3轮后共筛到7条结合肽,根据推论出的氨基酸序列合成结合肽,作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,其中3号肽、6号肽的培养上清及胞浆中的DHBV-DNA含量低于对照组(P<0.05).结论:与DHBVP特异结合的结合肽对DHBV的复制有抑制作用.
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噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
1985年,Smith GP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1].1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库.1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3].这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响.
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羟喜树碱结合肽的结合作用分析
目的:对羟喜树碱结合肽进行结合作用分析,为进一步研究阐明羟喜树碱的抗癌机制、耐药机制以及毒理机制提供帮助.方法:使用生物信息学软件对羟喜树碱结合肽序列进行比对分析,寻找羟喜树碱结合肤同源保守性模式,对羟喜树碱结合肽进行结合作用分析.结果:羟喜树碱结合肽原始序列的保守性模式为xxxxxLxPxxxx.其中L、P皆为疏水脂肪族氨基酸.依据氨基酸可以分为疏水脂肪族氨基酸、疏水芳香族氨基酸、极性带电氨基酸和极性不带电氨基酸的原则,分别以G、F、R、N四个符号来代表四大类氨基酸,对羟喜树碱结合肽原始序列进行了简并转换,羟喜树碱结合肽简并序列的保守性模式为xGxxGGGNxGGx.结论:预测羟喜树碱结合肽可能通过形成疏水口袋区与羟喜树碱发生相互作用,而疏水口袋中的易形成氢键的极性不带电氨基酸则可能与羟喜树碱形成氢键,进一步稳定加强其相互作用.
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牙釉质结合肽的淘选及亲和力分析的实验研究
目的:利用噬菌体表面随机肽展示技术淘选获得牙釉质结合肽.方法:以经过预处理的牙釉质片为模板,通过四轮淘选获得牙釉质结合肽的富集.从第3轮和第4轮产物中分离出总计20条单克隆进行测序及亲和力分析.结果:产物中噬菌体滴度在第2轮产物中得到大富集之后逐渐下降.所测序的20个单克隆中没有发现共有序列.其中有4个单克隆具有明显的强于WM13噬菌体的牙釉质结合力.结论:四个序列被认为具有较强的牙釉质结合能力.所测序列中未发现明显的共有序列.
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生长抑素受体显像与放射性核素治疗
近十年来,一类重要的放射性药物--放射性标记的受体结合肽的出现使核医学领域发生了巨大的变化.在脊椎动物,肽类物质通过与靶细胞表面的特异性受体结合来传递其生物功能.由于肽类物质分子小,易于从血液及其他非靶组织中迅速清除,且与靶组织表达的特异性受体具有高度亲和力.
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人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证
目的 获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础.方法 应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽.酶联免疫法进行靶向性验证.应用荧光染色技术初步探讨短肽细胞受体位置.制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性.结果 经过四轮一步有机相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示该短肽有较强的特异性.结论 应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了其靶向性.可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物.
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以特异性噬菌体为靶进行配基筛选的分子模建及活性鉴定
目的 利用计算机辅助分子模拟技术,分析TNF模拟序列与配基的结合.方法 利用计算机模建,对特异性模拟TNF的环七肽单表位克隆LCS-7(c-RRPAQSG-c)与以其为靶筛选获得的配基即TNFα结合肽LLT-18(EHMALTYPFRPP)及TNFα分子间相互结合作用进行分子模拟分析;并合成LLT-18进行ELISA鉴定与验证.结果和结论 计算机模建分析显示LLT-18与TNFα表位模拟肽之间结合作用同其与TNFα分子间相互结合作用具有相似性;固相合成LLT-18短肽可与TNFα结合,证明了以噬菌体为靶进行配基筛选及分子模建预测小分子肽相互作用的可行性.
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Neuropilin-1高亲和肽的筛选及初步鉴定
目的:利用合成的重组Neuropilin-1的蛋白分子对噬菌体随机七肽库进行筛选,以期获得能与Neuropilin-1分子具高亲和活性的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法:对包被好的rhNeuropi-lin-1蛋白,经过三轮“吸附-洗脱-扩增”后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,竞争抑制试验进一步分析其相关化学合成多肽的功能.结果:经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,ELISA鉴定结果显示2个阳性克隆具有较强结合活性.DNA测序显示其具有*FPS***的一致基序.阳性克隆与Neuropilin-1分子的结合能被其相关化学合成多肽FITC-DFPSPLW所抑制.结论:利用噬菌体随机展示肽库技术获得了与Neuropilin-1分子具特异性结合能力的小肽分子,为进一步基于Neuropilin-1的肿瘤血管生成抑制的研究奠定基础.
关键词： Neuropilin-1 噬菌体肽库 结合肽 淘选 -
乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合肽的筛选与鉴定
目的：筛选并鉴定与乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg ）特异性结合的多肽。方法将酵母表达的HBsAg包被在微孔板上，加入噬菌体进行随机肽库筛选，经过4轮筛选后，随机挑取15个克隆进行DNA测序，并通过夹心ELISA方法鉴定其亲和力，采用剂量依赖结合实验和竞争抑制实验检测其与 HBsAg结合的特异性。结果经过4轮筛选，得到一优势克隆No ．3，展示肽段为SSYAPYVWQPIA ，与 HBsAg有较强的亲和力，剂量依赖结合实验和竞争抑制实验证明克隆No ．3与HBsAg的结合是特异性的。结论利用噬菌体展示肽库技术可以获得HBsAg特异性结合肽，此多肽可以作为靶向分子用于乙型肝炎的基因治疗，为乙型肝炎的靶向基因治疗奠定实验基础。
关键词： 乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒表面抗原 噬菌体展示 结合肽 -
Endoglin特异性结合短肽筛选及功能分析
目的:对噬菌体随机12肽库进行筛选,寻求可与Endoglin结合的小分子短肽并测定其亲和常数.方法:经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定阳性克隆的DNA序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性,非竞争法ELISA固相法计算阳性噬菌体融合肽的亲和常数.结果:三轮生物筛选,噬菌体得到有效富集,竞争性ELISA显示6个阳性噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,测序获得5种多肽序列,优势序列为:AHKHVHHVPVRL,竞争抑制实验显示阳性噬菌体克隆与Endoglin有良好的亲和性,其亲和常数为:(1.431±0.293)×107 mol/L.结论:利用噬菌体肽库技术可以获得亲和力较强的Endoglin的结合肽,为今后进一步研究Endoglin在卵巢癌的早期诊断方面的作用奠定基础.
