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从噬菌体展示抗体文库筛选对虾白斑综合征病毒的单链抗体
对虾白斑综合征是一种严重危害对虾养殖业的病毒性疾病.由于目前对其病原体对虾白斑综合征病毒(WSSV)的研究不够深入,所以对WSSV的有效防治仍然是一大难题.为此,用完整的对虾白斑综合征病毒粒子作为靶抗原固相包被,淘选噬菌体展示单链抗体文库,得到两个能够与WSSV结合的单链抗体:E2和H4.单链抗体H4能够结合病毒并抑制病毒对原代培养的对虾淋巴细胞的感染,这些结果表明此单链抗体具有开发为诊断试剂盒和抗病毒药物的潜力.
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特异性抗人cyclin D1人源单链抗体的筛选
目的 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体并进行鉴定.方法 以原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人cyclinD1蛋白为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"淘选过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体,通过ELISA方法对获得抗体的特异性和结合活性进行分析鉴定.结果 经过4轮筛选,获得7株能与人cyclinD1蛋白结合的阳性克隆,其中3株噬菌体的可溶性表达单链抗体能与人cyclinD1蛋白有特异性结合活性.结论 利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出特异性的人源性抗人cyclinD1抗体.
关键词： 人cyclinD1蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体 淘选 -
利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位
目的从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位.方法制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体IgG,用此IgG包被酶标板对12肽库进行反复淘选,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析.结果获得一批阳性噬菌体克隆,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性.结论获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础.
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大规模噬菌体DNA测序样品制备方法的改进与应用
目的 优化大规模噬菌体DNA测序样品制备的方法,提高筛选效率.方法 通过PCR扩增噬菌体环七肽库第一轮、第二轮和第三轮淘选产物中含插入目的片段噬菌体DNA,经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序鉴定,并与经典的噬菌体DNA提取方法进行比较.结果 PCR扩增法和经典法制备的噬菌体DNA的测序成功率分别为92.73%、93.75%,差异无统计学意义(P>0.05);两种方法制备的同一个噬菌体克隆的DNA经测序鉴定显示测序结果一致;第一轮、第二轮和第三轮淘选产物的噬菌体克隆经PCR扩增和电泳鉴定,发现无插入目的片段的噬菌体克隆检出率逐轮增加分别为1.04%、4.17%和22.69%(P<0.01).结论 PCR扩增含插入目的片段噬菌体DNA的方法可使大规模噬菌体筛选和DNA测序更加方便、快捷、实用,值得推广.
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噬菌体展示随机十肽库的构建及抗WSSV单链抗体A1的模拟抗原表位的淘选和鉴定
本实验以pCANTAB 5 E噬菌粒为载体,成功构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并将其应用于抗原模拟表位的淘选和鉴定.将一种特异识别对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的单链抗体A1对十肽库和十五肽库分别进行淘选,结果得到一系列能与单链抗体A1特异性结合的阳性克隆.将这些阳性克隆所编码的多肽氨基酸序列与已知的单链抗体A1的抗原WSSV388片段氨基酸序列做比对,发现多数阳性多肽序列都与WSSV388片段序列的C端一处K····R··R·QS的氨基酸片段相似,由此推论单链抗体A1的模拟抗原表位可能是由该不连续氨基酸片段所构成的构象表位,而非线性表位.研究结果表明,噬菌体展示随机肽库技术是一种用于研究抗原表位结构的有效方法,有助于进一步探讨WSSV的结构蛋白的构象及功能,以及相应单链抗体与细胞受体相互作用的机理.
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Neuropilin-1高亲和肽的筛选及初步鉴定
目的:利用合成的重组Neuropilin-1的蛋白分子对噬菌体随机七肽库进行筛选,以期获得能与Neuropilin-1分子具高亲和活性的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法:对包被好的rhNeuropi-lin-1蛋白,经过三轮“吸附-洗脱-扩增”后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,竞争抑制试验进一步分析其相关化学合成多肽的功能.结果:经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,ELISA鉴定结果显示2个阳性克隆具有较强结合活性.DNA测序显示其具有*FPS***的一致基序.阳性克隆与Neuropilin-1分子的结合能被其相关化学合成多肽FITC-DFPSPLW所抑制.结论:利用噬菌体随机展示肽库技术获得了与Neuropilin-1分子具特异性结合能力的小肽分子,为进一步基于Neuropilin-1的肿瘤血管生成抑制的研究奠定基础.
关键词： Neuropilin-1 噬菌体肽库 结合肽 淘选 -
整合素αvβ3特异性结合肽的筛选及初步鉴定
目的 应用噬菌体随机肽库展示技术筛选能与整合素αvβ3分子具特异性结合功能的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法 根据整合素αvβ3分子细胞外配体结合区域的品体结构及蛋白质序列设计①～⑤号5条短肽,并作为筛选配基,分别经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,粘附试验进一步分析化学合成多肽的功能.结果 经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,以⑤号肽为代表,ELISA鉴定显示7个阳性克隆能与⑤号合成短肽有较强结合活性.进行DNA测序,多重序列分析获得2个多肽基序:****HRH,HWR****.粘附试验表明化学合成多肽FITC-HLPWHRH,FITC-HWRLHPH与表达整合素αvβ3的细胞株具有一定的亲和性,且结合能被αvβ3分子配体纤维连接蛋白所抑制.结论 通过噬菌体随机展示肽库技术在体外对合成的短肽进行筛选,可以获得与整合素αvβ3分子具特异性结合能力的小肽分子.
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用噬菌体表面展示技术筛选与肝癌细胞系结合的抗体模拟肽
目的:从噬菌体展示肽库中, 筛选可与肝癌细胞特异性结合的抗体模拟肽.方法: 通过生物淘选使噬菌体富集.利用ELISA法, 鉴定噬菌体单克隆原种的亲和性, 并进行统计学分析.通过竞争ELISA, 分析筛选所得抗体模拟肽的结合位点, 并进一步分析抗体模拟肽的序列组成.结果: 随着淘选次数的增加, 出现噬菌体的富集.ELISA的结果显示, 相对于正常肝细胞, 筛选所得环状7肽对肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7402均有良好的结合活性(P<0.05), 且与SMMC-7721细胞的结合活性明显优于与BEL-7402细胞的亲和性(P<0.05).在α=0.01的水平上, 7肽单克隆噬菌体原种可明显与scFv竞争结合SMMC-7721细胞(0.005＜ P<0.01).竞争性ELISA的结果显示, scFv在一定浓度(0～10-5)范围内, 随着scFv浓度的逐渐降低, 竞争抑制率也在逐渐减小.测序结果证实, 所挑选的7肽阳性克隆的测序结果均相同.结论: 通过淘选获得的抗体模拟肽(CLPRQSSFC)是有效的, 为导向治疗提供了新的实验依据.
