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表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验
应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0.PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达.重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4 096.重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础.
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鸡痘病毒载体启动子的优化
要提高外源基因在鸡痘病毒(FPV)载体的表达量,必须使用强启动子来控制表达.为构建较强的启动子组合,根据痘苗病毒天然启动子P7.5的结构,人工合成4条寡核苷酸,形成一个早期启动子和一个晚期启动子,其首尾可相互连接.利用分子生物学常用实验方法把合成的启动子进行不同组合,终形成10个较有代表性的启动子组合PS1～10.在其下游插入大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ,并进一步构建成鸡痘病毒转移载体pFBS1～10,同时以P7.5作对照构建成pFB7.5.以脂质体介导转染鸡痘病毒中国疫苗株282E4感染3h～4h后的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)单层.用蓝斑筛选法纯化病毒4次,终得到稳定的重组病毒.将纯化的重组病毒感染次代CEF,分别于感染后10h、24h、36h、48h、72h收获细胞,制备提取物,检测提取物中β-半乳糖苷酶的活性.通过计算比较,筛选出其中较强的启动子组合LLEE,其表达活性约为P7.5的3.5倍,为进一步构建高效表达的鸡痘病毒通用载体打下了良好的基础.
关键词： 人工合成 强启动子 β-半乳糖苷酶的活性 鸡痘病毒 -
共表达HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6重组鸡痘病毒的筛选
目的构建共表达中国株HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6(IL-6)的重组鸡痘病毒(FPV).方法分别将HIV-1 gag-gp120基因和IL-6基因插入到FPV表达质粒pUTAL复合启动子和单一启动子下游,构建重组FPV表达质粒pUTA-GE-IL6.利用脂质体法将重组质粒和FPV 282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,经BUdR加压筛选,重组病毒分别用SDS-PAGE和Western Bolt进行鉴定,观察病毒样粒子的形成和重组病毒在哺乳动物细胞中的表达,并分析其免疫原性.结果阳性重组病毒基因组点膜处有显色斑点,Western Bolt结果显示重组病毒表达了gag-gp120嵌合蛋白和IL-6,在病毒感染细胞中有反转录病毒样粒子形成,且重组病毒可在哺乳动物细胞中表达目的蛋白.小鼠免疫指标检测表明该重组病毒具有很好的免疫原性.结论成功构建了共表达中国株HIV-1 gag-gp120与IL-6的重组FPV,为HIV-1基因工程活载体疫苗和巨分子颗粒化疫苗的制备奠定了基础.
关键词： HIV-1 HIV包膜蛋白质gp120 白细胞介素6 鸡痘病毒 -
共表达中国株HIV-1 gp120与hIL-6的重组鸡痘病毒研究
目的构建共表达中国株HIV-1 gp120与人白细胞介素6(IL-6)的重组鸡痘病毒. 方法分别将HIV-1 gp120基因和hIL-6基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL复合启动子ATI-P7.5和P7.5串联启动子下游,构建重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GP-IL6.利用脂质体法将重组质粒和鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞.经BUdR加压筛选3次后,重组病毒分别用PCR、间接免疫荧光试验和Western blot进行鉴定,并进行小鼠免疫研究. 结果重组病毒基因组中可扩增出1.4kb大小片段,重组病毒感染细胞表面有绿色荧光物质,表达产物的Western blot分析表明重组病毒可表达gp120和hIL-6蛋白.重组病毒可刺激小鼠产生特异性体液免疫应答. 结论成功构建了共表达中国株HIV-1 gp120与hIL-6的重组鸡痘病毒,为研制HIV-1基因工程活载体疫苗提供有益的资料.
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含HN和VP3及IL-18重组鸡痘病毒体内抑制骨肉瘤细胞S-180效应的观察
目的:研究含凋亡素基因、鸡新城疫病毒的HN基因及IL-18基因的重组鸡痘病毒对小鼠骨肉瘤的抑制效应.方法:建立BALB/C小鼠荷S-180骨肉瘤模型,瘤内注射重组鸡痘病毒,测定肿瘤生长率、抑瘤率和小鼠血清唾液酸含量,肿瘤组织病理学分析检测重组鸡痘病毒对骨肉瘤的抑制效应.结果: rFPVHN、rFPVVP3和rFPV3(rFPVVP3IL-18)均对骨肉瘤有抑制作用,但rFPV3组抑瘤率高于rFPVHN 组、rFPVVP3组和鸡痘病毒野毒对照组达到51.7%,血清唾液酸含量明显减低(4.22±0.27),P=0.008 7.结论:凋亡素基因、鸡新城疫病毒的HN基因及IL-18基因联合应用具有协同抑制骨肉瘤的效应.
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如何防治鸡痘
鸡痘是由鸡痘病毒引起的传染病,多年来在全国各地都有发生.鸡群不同、地区不同、气候不同,它所造成的危害性也不同.
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共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia Ⅰ型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建
目的 构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和Asia Ⅰ型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒.方法 将酶切得到的FWDV O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282 E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU 3次加压筛选.挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定.结果 重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确.经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒.结论 已成功构建了共表达FMDV O型P1-2A-IL-18基因和Asia Ⅰ型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒.
关键词： 口蹄疫病毒 鸡痘病毒 P1-2A-IL-18基因 P1-2A-3C基因 -
表达PRRSV GP5、GP3和猪IL-18的重组鸡痘病毒的构建及鉴定
目的 研制安全有效的预防猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组鸡痘病毒活载体疫苗.方法 将PRRSV长春株的GP5和GP3基因插入到含有猪IL-18基因的鸡痘病毒转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL-IL-18-GP5-GP3.将该重组质粒与鸡痘病毒(FPV)282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组.通过3次BrdU加压筛选,经PCR、RT-PCR和IFA方法鉴定重组病毒.结果 从重组鸡痘病毒基因组和总RNA中扩增出340 bp的目的基因片段,感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达.结论 已成功构建1株重组鸡痘病毒,并可正确表达PRRSV ORF5/ORF3基因.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5 GP3 鸡痘病毒 -
HIV-2 Gp105基因重组鸡痘病毒的构建及鉴定
目的研制预防HIV-2的重组鸡痘病毒活载体疫苗.方法将HIV-2Gp105基因插入鸡痘病毒转移载体pUTA2复合启动子的下游,构建鸡痘病毒转移载体pUTA2-Gp105.将该重组质粒与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组.通过3次BrdU加压筛选,以PCR、RT-PCR、IFA和Western blot鉴定重组病毒.结果从重组鸡痘病毒的基因组和总RNA中能扩增出大小为653 bp的目的基因;感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应;表达产物与人HIV-2血清发生阳性反应,目的蛋白相对分子质量约为105 000.结论成功获得1株重组鸡痘病毒,可正确表达HIV-2 Gp105基因.
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柔嫩艾美球虫杂交株F2 SO7基因重组鸡痘病毒的构建和筛选
目的 构建柔嫩艾美球虫(E.tenella)杂交株F2 SO7基因重组鸡痘病毒.方法 将柔嫩艾美球虫杂交株F2 SO7基因,插入到以胸苷激酶(TK)基因为侧翼的鸡痘病毒表达载体pUTA2中的复合启动子下游,获得重组表达质粒pUTA-SO7.用脂质体将重组表达质粒转染鸡痘病毒(FPV)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),培养、收获病毒后,用含40 mg/L5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)的培养液,在TK基因阳性CEF细胞中筛选培养2代,然后用不含BrdU的培养液进行病毒噬斑纯化以筛选rFPV.结果 PCR扩增可见650 bp左右蛋白条带,间接荧光抗体试验(IFAT)可见重组病毒感染细胞表面有绿色荧光物质,蛋白质印迹分析(Western Blotting),在相对分子质量(Mr)36000处有1条特异条带,证实了重组病毒在CEF中表达了SO7基因.结论 成功筛选出表达E.tenella杂交株F2 SO7基因的重组鸡痘病毒.
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人类免疫缺陷病毒-2 gag重组鸡痘病毒疫苗的构建及实验免疫研究
目的 构建并探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)-2 gag重组鸡痘病毒(FPV)在小鼠体内的免疫应答,为开发HIV-2基因重组活载体疫苗提供实验依据.方法 将HIV-2结构基因gag插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pUTA2-gag;经转染和BrdU加压筛选,以基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌内注射免疫Balb/c小鼠,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果 构建出重组鸡痘病毒转移质粒pUTA2-gag;从重组病毒的基因组中可扩增出大小为766 bp的目的基因,其表达产物可与人HIV-2阳性血清发生反应,目的蛋白的相对分子质量约为55 000;重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类的数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.结论 获得一株重组鸡痘病毒,该病毒可稳定表达HIV-2结构蛋白Gag,并能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.
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鸡痘的诊断与防治技术研究
鸡痘是危害养鸡业发展的一种传染病,不分日龄大小均可发病,肉鸡和蛋鸡均可感染,发病期1-2周,雏鸡死亡率较高,可达5%～30%不等[1],近年来发病率和死亡率有上升趋势,并且免疫失败的病例时有发生[2].为了建立接种疫苗后抗体监测手段和研究感染鸡痘病毒后抗体产生规律,我们建立了间接ELISA检测鸡痘病毒抗体的方法,进一步做了中和试验和用阳性血清治疗鸡痘的试验,报告如下.
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鸡痘病毒ORF214原核表达蛋白单克隆抗体的制备及其初步鉴定
目的:经发表的鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)ORF214基因序列,利用PCR方法扩增出目的片段,测序后并克隆至原核表达载体pET-28a,用表达产物制备抗FPVORF214蛋白单克隆抗体(mAb).方法:以鸡痘病毒ORF214原核表达蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,用间接ELISA方法检测筛选.结果:阳性细胞株经3代克隆纯化后,获得3株能稳定分泌抗FPV ORF214蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2F10C9、3C3 B10、2G8G7.3株杂交瘤细胞分泌的抗体均能够特异地与FPV ORF214蛋白反应,细胞上清ELISA效价均在1×102以上,mAb腹水效价达1×104以上.结论:该特异性mAb的研制成功为进一步研究ORF214的生物学特性奠定基础.
关键词： 鸡痘病毒 ORF214 单克隆抗体(Mab) -
在鸡痘病毒中共表达HIV-1 gp120与IL-2基因
外膜蛋白gp120是HIV-1主要结构蛋白之一,它的V3区存在着中和抗体决定簇、CTL决定簇,以及对巨噬细胞和脑组织纤维特异性识别的区,与HIV-1可诱导中和抗体应答、特异性细胞毒反应及分子致病机制密切相关[1,2].
