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HIV-2 gp105-gag截短体在毕赤酵母中重组表达研究
目的实现HIV-2ROD gp105-gag截短体重组蛋白tgp105-gag的高效分泌表达,对其表达条件进行研究. 方法用PCR方法获得HIV-2ROD tgp105截短基因,将其与HIV-2ROD gag构建HIV-2ROD tgp105-gag嵌合基因并克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9中,转化GS115酵母菌,经MD/MM表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆,以甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE分析及Western blot证实. 结果 HIV-2ROD tgp105-gag嵌合截短基因在Pichia pastoris酵母系统中获得了有效分泌表达,相对分子质量(Mr)约为140×103,表达量约为16%,表达产物可被HIV-2阳性血清识别.佳表达条件是大于85%的溶解氧,摇瓶转速240r/min,1.0%～1.5%甲醇诱导,培养时间3?d. 结论在Pichia pastoris表达系统中实现了HIV-2ROD tgp105-gag蛋白的有效分泌性表达,表达产物具有良好的抗原特异性.
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不同人类免疫缺陷病毒2型检测方法的比较研究
目的通过随访调查16例人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2)可疑感染者,初步评价HIV-2的几种检测方法.方法从贵州省采集既往经HIV-1/2免疫印迹(WB)试验检测出现HIV-2指示带的16份受检者的全血样品,进行HIV-2抗体和核酸检测.血浆中的抗体用HIV-1/2 ELISA初筛-复检,其中阳性样品再分别用HIV-1/2线性免疫试验(LIA)和HIV-2 WB检测.外周血单核细胞(PBMC)中的前病毒DNA用HIV-2巢式PCR检测.结果 16份血浆样品经HIV-1/2 ELISA筛查均为HIV抗体阳性;用HIV-1/2 LIA检测,全部为HIV-1抗体阳性,15份为HIV-2抗体阴性、1份不确定;用HIV-2 WB检测,有3份为HIV-2抗体阳性、13份不确定.由于这批样品的采样时间距首次检测至少1年以上,可以排除窗口期感染,上述检测结果不确定的受检者均可判为HIV-2抗体阴性.此外,用巢式PCR检测所有PBMC样品均为HIV-2核酸阴性.结论 16例受检者全部为HIV-1而非HIV-2感染,HIV-1/2 LIA的抗体检测结果与HIV-2核酸检测结果基本相符,而HIV-2 WB则产生了大量的不确定甚至假阳性结果.
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抗HIV-2 gp36基因工程抗原单克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备稳定产抗人类免疫缺陷病毒-2gp36基因工程抗原单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb,单抗)的杂交瘤细胞株及相应单抗,鉴定细胞株的生物学特性和单抗的免疫学特性及理化特性;初步探索用所制单抗构建检测gp36酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的适用性.方法 分别用杂交瘤技术和常规免疫制备抗gp36的单抗和多抗(polyclonal antibody,PcAb,多抗).纯化单抗和多抗,并标记辣根过氧化物酶.分别用纯化的单个单抗-单个单抗或单个单抗-多抗建立夹心ELISA.结果 获得9株稳定分泌抗gp36单抗的杂交瘤细胞株.用纯化的8E5单抗和辣根过氧化物酶标记的多抗建立的夹心ELISA可以检测到低至50 μg/L的gp36.结论 为人类免疫缺陷病毒-2感染的检测和研究初步提供了可资应用的单抗.
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富马酸替诺福韦酯的研究进展
诺福韦酯（tenofovir DF）是一种替诺福韦的口服前药，是一种核酸类似物，对HIV-1、HIV-2和乙肝病毒等有很强的抑制作用。替诺福韦酯被吸收后将很快地转化为替诺福韦，在细胞内很快地合成替诺福韦二磷酸代谢物，而竞争性地抑制HIV-1逆转录酶，从而阻止了病毒DNA链的合成。
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应用PRPL串联启动子表达HIV-2gag蛋白
目的:探讨HIV-2 gag 非融合蛋白的表达.方法:应用DNA重组技术,将HIV gag基因全序列(gag)和部分(gag')cDNA片段克隆到pBV220载体PRPL串联启动子下游,构建成HIV-2 gag重组表达载体pBV-gag和pBV-gag',在大肠杆菌中表达.结果:SDS-PAGE显示pBV-gag'在21 kD处可见一明显的额外蛋白带,经薄层扫描分析占菌体总蛋白的6.1%,蛋白印迹结果证明,表达出的特异蛋白分子量pBV-gag为57 kD和47 kD;pBV-gag'为47 kD和21 kD.经提取包涵体证明,表达的蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中.结论:HIV-2 gag非融合蛋白可在大肠杆菌中获得表达并主要以包涵体形式存在.
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人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2)gag蛋白基因在毕赤酵母中的克隆表达
目的:实现HIV-2ROD gag重组蛋白的分泌表达,为研究HIV-2ROD gag蛋白结构与功能及亚单位蛋白疫苗研究打下基础.方法:将HIV-2ROD gag蛋白基因片段,与分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9重组,构建了相应的重组表达质粒pPIC9-gag,转化GS115酵母菌,经MD/MM表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆,以甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE分析及Western blot证实.结果:获得了HIV-2ROD gag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中的分泌表达,表达产物可被HIV-2抗血清识别,分子量约为57 kD.结论:pPIC9-gag重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HIV-2ROD gag蛋白,该蛋白具有强免疫学活性.
关键词： HIV-2 Gag Pichia pastoris 基因表达 -
人免疫缺陷病毒Ⅱ型gag基因在毕赤酵母中表达条件的研究
目的:提高人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2ROD)gag基因在毕赤酵母中的表达量.方法:研究了转化子生长的培养条件,包括不同的甲醇诱导浓度、诱导时间、溶解氧、摇瓶转速及不同pH值对人HIV-2 gag表达的影响.表达产物进一步通过盐析和Sephadex G-100分子筛层析柱层析分离纯化.结果:佳表达条件是1.0%甲醇诱导,诱导时间3 d, 大于85%的溶解氧,摇瓶转速250 rmin-1,pH6.0～6.5,目的蛋白表达量达到21 mg*L-1.同时,经纯化后得到了纯度大于95%的目的蛋白.结论:获得了HIV-2ROD gag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中分泌表达的佳表达条件.
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HIV-2gp105重组疫苗联合免疫引起小鼠更强的免疫应答
目的:探讨应用prime-boost免疫策略进行HIV-2外膜蛋白重组鸡痘病毒与重组DNA疫苗联合免疫引起小鼠的免疫应答.方法:将HIV-2 gp105重组DNA疫苗与重组鸡痘病毒以prime-boost免疫策略,免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾CD4+、CD8+T细胞亚群的数量、脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度.结果:重组DNA疫苗和重组鸡痘病毒prime-boost免疫策略和两种疫苗单独免疫均刺激小鼠产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性及特异性抗体,联合免疫组特异性CTL杀伤活性及特异性抗体水平高于单独免疫组(P<0.05).结论:以HIV-2 gp105重组DNA疫苗进行基础免疫、以HIV-2 gp105重组鸡痘病毒进行加强免疫的prime-boost免疫策略能诱导小鼠产生更强的特异性细胞和体液免疫应答.
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深圳地区人类免疫缺陷病毒-1型AE重组毒株的分子流行病学研究
HIV的一个重要生物学特征是基因的高度变异.目前,世界上已发现的HIV可分为HIV-1和HIV-2两型,HIV-1型又可分为M(Main)组、O(the Outline)组和N(Non-M,Non-O)组.
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人类免疫缺陷病毒-2 gag重组鸡痘病毒疫苗的构建及实验免疫研究
目的 构建并探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)-2 gag重组鸡痘病毒(FPV)在小鼠体内的免疫应答,为开发HIV-2基因重组活载体疫苗提供实验依据.方法 将HIV-2结构基因gag插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pUTA2-gag;经转染和BrdU加压筛选,以基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌内注射免疫Balb/c小鼠,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果 构建出重组鸡痘病毒转移质粒pUTA2-gag;从重组病毒的基因组中可扩增出大小为766 bp的目的基因,其表达产物可与人HIV-2阳性血清发生反应,目的蛋白的相对分子质量约为55 000;重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类的数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.结论 获得一株重组鸡痘病毒,该病毒可稳定表达HIV-2结构蛋白Gag,并能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.
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HIV-2gag-gp105嵌合基因DNA疫苗对小鼠的免疫原性研究
利用真核表达载体pVAX1构建HIV-2 gag-gp105嵌合基因的重组质粒pVAX1gag-gp105,将其转入BHK21细胞中,利用间接免疫荧光方法检测其表达情况.进一步分别将核酸疫苗质粒pVAX1gag-gp105、对照组质粒pVAX1和PBS溶液经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾CD4+、CD8+T细胞亚群的数量,脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度.结果显示,重组核酸疫苗质粒pVAX1gag-gp105疫组小鼠脾CD4+、CD8+T细胞亚群的数值均比对照组高(P＜0.01),脾特异性CTL杀伤活性与对照组相比差异极显著(P＜0.01),血清抗体滴度显著高于对照组(P＜0.01).以上结果表明,HIV-2 gag-gp105嵌合基因DNA疫苗对BALB/c小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性.
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评估HIV抗体阳性血清试剂结果分析
作者在近2年对HIV抗体检验试剂评估中先后选用4份不同型的HIV抗体阳性标准品,发现部分国产试剂对检测HIV-2和一些HIV亚型样本的灵敏度偏低,现报道如下.
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广州市发现首例HIV-1/HIV-2混合感染
目的探讨首例HIV-1/HIV-2混合感染发现的经过以及对本地艾滋病预防控制的意义.方法对广州市某医院一名门诊患者血样2份(包括初筛试验前后各1份)进行HIV抗体检测.初筛试验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和明胶颗粒凝集试验(PA),确认试验采用蛋白印迹法(WB).结果患者为男性,非洲马里人,血清经初筛试验为HIV阳性.初筛阳性的血清,以HIV-1/HIV-2 HIVBLOT2.2试剂做蛋白印迹试验(WB),确认为HIV-1阳性,同时HIV-2的特异条带gp36阳性;样本再用HIV-2型的BLOT1.2膜条确认为HIVV-2阳性.结论被检者为HIV-1/HIV-2混合感染,这是广州市、广东省首次发现HIV-1/HIV-2混合感染,提示HIV-2可能会以对外交流等方式传入广东.
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我国人类免疫缺陷病毒2型感染的初步回顾性血清学调查
[目的]初步了解我国人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2)的感染状况.[方法]用多种HIV抗体确认方法检测来自全国各地的HIV-2可疑血浆/血清样品,用Genelabs HIV Blot 2.2 WB检测5份已知HIV-2血浆样品.[结果]用Genelabs HIV Blot 2.2 WB检测54份HIV-2可疑样品,全部呈HIV-1抗体阳性反应且有HIV-2指示带;用HIV-2 WB试剂检测,44.4%(24/54)呈HIV-2抗体阳性反应、55.6%(30/54)呈不确定反应;用2种线性免疫试验检测,分别只有3.7%(2/54)和1.9%(1/54)判定为HIV-1/2混合感染,绝大部分仅为HIV-1抗体阳性.对于5份已知HIV-2样品,使用Genelabs HIV Blot 2.2 WB检测时与HIV-1抗原发生不同程度的交叉反应,但带型明显不同于HIV-1样品.[结论]结果提示我国的HIV-2感染很少见,现有的HIV-2 WB不宜用于检测HIV-1抗体呈阳性反应的样品.
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人免疫缺陷病毒Ⅱ型核心蛋白DNA疫苗的实验免疫研究
目的检测HIV-2核心蛋白DNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的能力.方法将表达HIV-2核心蛋白DNA疫苗质粒pVAXIgag肌注Balb/c小鼠,分析CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量、脾特异性CTL反应、血清中HIV-2的特异性抗体水平.结果重组质粒pVAXI-gag免疫组与空载体pVAXI及PBS对照组相比较差异显著,血清抗体滴度及淋巴细胞杀伤效应为P＜0.01,脾T细胞亚群的数量为P＜0.05.结论HIV-2核心蛋白DNA疫苗能诱导Balb/c小鼠产生特异性细胞免疫应答和体液免疫应答.
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HIV-2 DNA疫苗免疫小鼠的免疫反应观察
目的用构建的HIV-2 外膜蛋白gp105和核心蛋白gag基因的DNA疫苗免疫小鼠,评价其免疫效果.方法将HIV-2型 gp105和gag基因克隆到表达载体pIRES1neo中,构建重组DNA疫苗质粒.间接免疫荧光试验证明,构建的DNA疫苗在真核细胞中表达了gp105或/和gag.构建的疫苗免疫小鼠后,用流式细胞仪测定CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚类数, 并用HIV-2抗体ELISA检测试剂盒检测免疫鼠血清中抗HIV-2抗体水平.结果构建了3种HIV-2 DNA疫苗pIRES1gag、pIRES1gp105和pIRES1gag-gp105,转染BHK细胞后均能表达抗原蛋白,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖并诱导产生抗HIV-2特异性抗体,其中pIRES1gag-gp105免疫鼠中,淋巴细胞增殖显著,而pIRES1gp105免疫鼠中HIV-2特异性抗体水平高.结论构建的DNA疫苗均能诱导机体产生免疫反应,其中pIRES1gp105诱导的体液免疫应答显著,而pIRES1gag-gp105诱导的细胞免疫响应显著.
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围生期人免疫缺陷病毒感染的临床决策和治疗
获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)又称艾滋病,是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起的传染病.HIV为RNA逆转录病毒,分为HIV-1型和HIV-2型,目前在世界范围内流行的约95%为HIV-1型.HIV-1型的母婴传播率较高,感染HIV-1型的妇女在怀孕、分娩或产后哺乳的过程中可将HIV垂直传染给胎儿或婴儿,导致胎儿或婴儿感染,HIV-2型则极少发生母婴传播.
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小鼠对HIV-2 gp105核酸疫苗免疫应答的研究
目的: 探讨HIV-2 gp105基因核酸疫苗在小鼠体内的免疫应答, 为开发HIV-2 核酸疫苗提供实验依据. 方法: 将HIV-2外膜蛋白(gp105)基因插入真核表达质粒载体pVAX1中, 构建pVAX1-gp105重组表达质粒. 将其肌注免疫BALB/c小鼠, 用ELISA法检测小鼠血清抗HIV-2抗体, 用流式细胞仪测定CD4+、 CD8+ T细胞亚群数, 以乳酸脱氢霉释放法检测脾特异性CTL的杀伤活性.结果: 重组质粒pVAX1-gp105免疫组小鼠的血清抗体滴度、脾 T细胞亚群的数量及特异性CTL的杀伤活性, 均明显高于对照组, 分别为P<0.01, P<0.05和P<0.01.结论: HIV-2 gp105核酸疫苗能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫.
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HIV-1与HIV-2交叉反应毒株的基因亚型分析
目的 分析HIV-1+2蛋白印迹试验中HIV-1确证阳性同时出现HIV-2带型样本的基因亚型.方法 将HIV-1+2确证试验中同时出现HIV-2带型的样本,通过基因诊断确认是否为HIV-2共感染;同时扩增HIV-1gag,env基因段,通过测序和系统进化树的构建,分析具有HIV-2带型的HIV-1毒株的基因亚型.结果 在34份出现HIV-2带型的标本中,基因诊断发现均为交叉反应,并非HIV-1和HIV-2共感染.出现交叉反应的毒株中以AE亚型为主,占73.5%(25/34),BC重组和B亚型分别占17.7%(6/34)和8.8%(3/34).结论 HIV-1+2蛋白确证试验中HIV-1确证阳性,同时出现HIV-2带型的阳性样本,并非HIV-1和HIV-2共感染,而是交叉反应.出现交叉反应的HIV-1毒株以AE亚型为主.
