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人端粒酶逆转录酶永生化MRC-5细胞方法的建立
目的 通过携带人端粒酶逆转录酶(hTERT)的慢病毒颗粒转染法,制备可用于人巨细胞病毒(HCMV)培养的永生化MRC-5细胞.方法 以携带hTERT基因的质粒pLXSN-hTERT为分子基础,通过PCR构建慢病毒载体质粒pLVX-EFl a-hTERT.pLVX-EF1 a-hTERT质粒与Lenti-X HTXPackaging Mix2混合后转染293T细胞,并经Real-time PCR定量所获得的慢病毒颗粒,在慢病毒原液感染MRC-5细胞后连续传代获得永生化的MRC-5T细胞,并观察HCMV在MRC-5T细胞中的感染特性.结果 获得了表达hTERT基因的慢病毒颗粒LVX-EF1a-hTERT,制备了可用于HCMV培养的永生化MRC-5细胞.结论 建立了人端粒酶逆转录酶永生化MRC-5细胞的方法,为永生化原代细胞等其他种类细胞提供了技术保障和物质基础.
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检测HIV-1逆转录酶活性的ELISA方法的建立
目的建立检测HIV-1逆转录酶活性的ELISA方法. 方法应用包被的模板和逆转录酶将生物素标记的dUTP掺入,用辣根过氧化物酶反应系统检测酶活性. 结果建立了检测HIV-1逆转录酶活性的ELISA方法,并与同位素掺入检测法进行了比较,用ELISA法检测了PFA等药物对HIV-1逆转录酶活性的抑制作用,对ELISA法的重复性、稳定性及用于抑制剂研究的特异性和敏感性进行了评价. 结论 HIV-1 RT活性的ELISA检测法具有简便、快速、重复性好、特异性强的特点,适用于抗HIV-1逆转录酶药物的大样品量筛选工作,并可发展成为高通量技术.
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S-DABO类非核苷类逆转录酶抑制剂分子对接及Field-Based QSAR研究
HIV-1逆转录酶抑制剂是鸡尾酒疗法,即高效抗逆转录病毒治疗的主要组成成分,S-DABO系列化合物及其类似骨架对HIV-1逆转录酶表现出良好的抑制活性.本文基于公共骨架叠合的方法生成了基于场的三维定量构效关系模型(Field-based QSAR model),并通过高斯立体场、静电场、疏水场、氢键供体场、氢键受体场和芳环场来表征.对应的统计学参数训练集交叉验证相关系数R2CV为0.5949,相关系数R2为0.8421,测试集Q2为0.5486,测试集相关系数Pearson-r为0.7460.通过分子对接,分子结合口袋分析以及三维等势图分析,我们得到了关键的药效基团与相互作用:(i)化合物与氨基酸残基Tyr181,Tyr188,Trp229存在π-π相互作用,与His236之间存在σ-π相互作用;(ii)化合物与Lys101之间存在氢键,与Tyr188之间存在卤键.对接分析和Field-based QSAR模型可以为新型HIV-1逆转录酶抑制剂的设计提供借鉴和帮助.
关键词： HIV-1逆转录酶 S-DABOs 分子对接 基于场的三维定量构效关系 -
相似的吡啶酮类化合物具有显著不同的抗HIV-1逆转录酶活性
在结构多样的非核苷类逆转录酶抑制剂中,吡啶酮类化合物对于HIV-1野生株病毒和突变株病毒均表现出了良好活性.在对课题组前期的毗啶酮类抑制剂LAM-trans进行结构改造的过程中,我们发现在4位引入氮原子可以显著改善化合物的水溶性,但是结构中哌啶N原子的质子化导致了化合物与结合口袋疏水作用力的减弱.特别的是,质子化改变了脂环在疏水口袋中的取向,进而阻碍了关键卤素键的形成并终导致抗HIV-1逆转录酶活性的巨大改变.这些研究结果,为以后吡啶酮类化合物的结构改造提供了一定的理论基础和实验依据.
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HIV-1逆转录酶抑制剂的合成及活性评价
本研究以HIV-1逆转录酶为靶点,设计了一类具有HEPT类结构的化合物:1-乙氧基甲基/苄氧基甲基-5-卤代-6-脂肪胺尿嘧啶作为抑制剂,并对合成的目标化合物进行了生物活性测定,一些化合物显示出较强的抗HIV生物活性,与对照物奈韦拉平相比(IC50 8.30μM)化合物1d,1m和1n的IC50 值分别达到了13.3,11.7和3.15 μM.
关键词： HIV-1逆转录酶 非核苷类逆转录酶抑制剂 HEPT类似物 -
HIV 逆转录酶抑制剂酶联免疫评估方法的研究
目的:建立检测逆转录酶活性的酶联免疫吸附实验方法,用于筛选人类免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶抑制剂.方法:利用DNA的固相固定技术将引物固定于96孔微量滴定板上,以poly(rA)· Oligo(dT)15为模板,在逆转录酶的作用下,将生物素标记的dUTP掺入,用碱性磷酯酶反应系统检测酶活性.结果: 建立了检测逆转录酶活性的酶联免疫(ELISA)法,并用ELISA法验证了已知阳性药物对逆转录酶的抑制作用,对ELISA法在动力学研究的应用做了初步探讨,评估ELISA法的重复性、稳定性、特异性和敏感性.结论: ELISA 法检测HIV-1 逆转录酶活性具有简单、快速、特异性强、重复性好、污染小等特点,适用于以HIV-1 逆转录酶为靶点的抑制剂的筛选及相关机制的研究.
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非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂研究进展(待续)
逆转录酶是设计抗艾滋病药物研究的选择性的靶点,逆转录酶抑制剂主要分为核苷类和非核苷类两大类,本文主要根据化学结构类型综述近年来非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂的研究进展.
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富马酸替诺福韦酯的研究进展
诺福韦酯（tenofovir DF）是一种替诺福韦的口服前药，是一种核酸类似物，对HIV-1、HIV-2和乙肝病毒等有很强的抑制作用。替诺福韦酯被吸收后将很快地转化为替诺福韦，在细胞内很快地合成替诺福韦二磷酸代谢物，而竞争性地抑制HIV-1逆转录酶，从而阻止了病毒DNA链的合成。
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复叶耳蕨提取物体外抗HIV-1RT活性的研究
目的 对鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物复叶耳蕨不同提取部位体外抗HIV-1逆转录酶活性进行研究.方法 在体外无细胞系统内采用酶联免疫吸附测定HIV-1逆转录酶的半数有效浓度(IC50).结果 复叶耳蕨乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物抑制HIV-1逆转录酶的半数有效浓度IC50分别为84.06,9.74 μg· ml-1,水提取物抑制HIV-1逆转录酶的半数有效浓度IC50 > 200 μg·ml-1.结论 复叶耳蕨乙酸乙酯提取物与正丁醇提取物具有体外抑制HIV-1逆转录酶作用.
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分子对接技术筛选抗HIV-1逆转录酶活性化合物
【目的】通过分子模拟和活性测试筛选非核苷类抗人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）逆转录酶活性化合物。【方法】采用Tripos SYBYL软件Surflex-Dock分子对接模块，模拟SPECS数据库中22000个化合物与HIV-1逆转录酶活性口袋的结合，根据模拟结果分析化合物与HIV-1逆转录酶晶体结构的相互作用模式。对于打分较高与结合模式较优的化合物，采用体外抗HIV-1活性测试方法检测其生物活性。【结果】虚拟筛选结果显示化合物1-（4-fluorophenyl）-3-[2-（1H-indol-3-yl） ethyl] thiourea对接构象与晶体结构中内嵌配体非常接近，它与HIV-1逆转录酶结合口袋重要残基Lys101形成氢键、与保守残基Trp229和芳香残基Tyr181分别形成π-π堆积作用。体外抗HIV-1活性测试结果显示其抑制HIV-1I IB病毒感染的C8166淋巴细胞合胞体形成50%时的浓度即EC50值为5.45μg/mL。【结论】分子对接技术能缩小活性化合物筛选范围，并可用于预测化合物与蛋白质的相互作用模式，本研究利用该技术筛选出活性化合物。
