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SFTS病毒感染脾脏网状成纤维细胞系的建立
目的 分离、纯化、培养和永生化小鼠脾脏原代网状成纤维细胞(fibroblastic reticular cells,FRCs),筛选和鉴定永生化的FRCs克隆,证明永生化FRCs可用于SFTS病毒(SFTSV)体外感染研究.方法 使用磁珠和流式细胞分选等技术分离、纯化和培养小鼠脾脏FRCs;使用SV40永生化FRCs,筛选单克隆并培养50代以上,使用转录组测序(RNA Sequencing,RNA-seq)和激光共聚焦技术对原代和永生化的FRCs进行比较和鉴定;用SFTSV体外感染的永生化的FRCs.结果 成功得到4个永生化的FRCs克隆;鉴定结果显示Clone02符合FRCs表型,且纯度均达到了99％;转录组测序相关性分析显示Clone02细胞株基因表达与原代FRCs接近;基因表达分析和激光共聚焦实验证实Clone02的表型和原代FRCs相同;SFTSV在MOI值0.5的条件下即可成功感染Clone02细胞.结论 永生化的FRCs Clone02细胞保持了原代细胞的形态学、免疫学特征,与原代FRCs基因表达谱接近,可被SFTSV体外感染,是一个新的有潜力的SFTSV体外研究的细胞平台.
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罗丹明123分离肝癌细胞系HepG2异质性亚群的鉴定
目的:建立分离肝癌细胞系HepG2中对罗丹明123(Rho123)染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌异质性研究中的意义.方法:利用流式细胞分选术(FCM)并结合不同浓度的Rho123染料,分析和分选肝癌细胞系HepG2细胞中具有不同染料排斥能力的肝癌细胞亚群,再通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法,以比较不同肝癌细胞亚群的差异.结果:根据不同染料排斥能力可以将肝癌细胞系HepG2细胞分为Rholow和Rhohigh2个亚群,2个亚群在倍增时间(16.9 h vs 24.7 h)、大增生倍数(15.2 vs 12.3)、克隆形成率(50%vs 20%)以及甲胎蛋白(AFP)的表达(31/32 vs 20/26)以及裸鼠成瘤实验(7/10 vs 1/10)上具有显著性差异(均P＜0.01),Rholow亚群是具有干细胞特性的.结论:Rho123结合FCM可以富集具有干细胞特性的Rholow亚群,同时进一步证实肝癌的异质性.
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大肠癌干细胞分选与鉴定的研究进展
肿瘤干细胞理论认为结肠癌的发病、转移与复发与大肠癌干细胞(colorectal cancer stem cells,CCSCs)有关,因此分离纯化大肠癌干细胞对于结肠癌的预防,诊断及治疗具有重要意义.本文就大肠癌干细胞的分选与鉴定方法作一综述.
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流式细胞分选术和Rho123在分离MHCC97肿瘤干细胞中的应用
目的:肝癌组织中可能存在具有表型和功能特殊的肝癌细胞,分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移具有重要的意义.寻求分离MHCC97肿瘤干细胞的有效方法,探讨角蛋白(CK-19)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异.方法:实验于2006-11/2007-05在解放军第四军医大学免疫实验室和肝胆外科实验室完成.细胞来源:MHCC97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供.实验方法:MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×109 L-1.每份取1×106个细胞,参考Rho123对线粒体膜电位测定的0.1 mg/L质量浓度,分别做0.1 mg/L和0.05 mg/L两个质量浓度细胞梯度染色,对照组加入维拉帕米(终浓度50 mmol/L),以未加Rho123作为阴性对照.实验评估:采用免疫细胞化学方法观察细胞角蛋白19在0.05 mg/L Rho123细胞及0.1 mg/L Rho123两组中的表达和含量.结果:单纯加入Rho123组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组无此区域,即0.05 mg/L Rho123细胞占总数的2.1%,其余为0.1 mg/L Rho123组细胞.两组细胞内均有细胞角蛋白19阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,两组比较有统计学差异(P＜0.05)结论:细胞角蛋白19在肝癌细胞亚群中表达有差异,强阳性多数分布在0.05 mg/L Rho123组中,Rho123结合流式细胞分选术可以有效地分选出癌细胞中的肿瘤干细胞.
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人肝癌细胞系中CD90+细胞的生物学特性
目的：筛选肝癌细胞系中CD90（Thy-1）阳性表达的细胞，初步探讨CD90+细胞亚群的干细胞特性。方法利用流式细胞分选术筛选5种肝癌细胞株（HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及SK-Hep-1）中CD90（Thy-1）阳性表达的细胞，以平板克隆形成实验观察其增殖能力，CCK-8法观察CD90+细胞的增殖能力和顺铂对CD90+细胞的抑制率。结果肝癌细胞株Sk-Hep-1中有66.02%的细胞CD90呈阳性表达。平板克隆形成实验显示CD90+细胞克隆形成率为（18.60±2.95）%，显著高于CD90-细胞及未分选细胞，差异有统计学意义（P<0.05）。体外实验显示培养4 d后CD90+细胞的增殖较CD90-及未分选细胞明显加快；CD90+细胞在相同浓度的顺铂作用下其抑制率较CD90-细胞和未分选细胞明显降低，三者的抑制率分别为14.8%、29.7%和24.0%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论肝癌细胞中的CD90+细胞是具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群，CD90可能是肝癌干细胞候选的分子标志物。
