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基于计算机辅助水解的中药大豆寡肽的ETA拮抗活性预测
中药寡肽是中药发挥药效的关键组分之一,系统地研究中药寡肽的组成及其药效是中药物质基础及作用机制研究的关键.该研究拟基于计算机辅助水解和分子对接等模拟技术,以中药大豆为研究载体,解析其降压寡肽成分,并预测其潜在的内皮素受体A(endothelin receptor A,ETA)拮抗活性.该文通过收集大豆中的储存蛋白序列,基于计算机辅助水解方法进行蛋白的模拟消化水解,并将水解获得的寡肽构建虚拟结构数据库.随后该研究构建了ETA肽类拮抗剂的药效团模型,包括1个疏水特征、1个负电中心、1个芳环特征和5个排除体积.同时,利用同源模建方法构建ETA的蛋白三维结构模型,并将其用于分子对接研究,采用一致性打分评价化合物的ETA拮抗活性.通过构建ETA肽类拮抗剂的药效团模型、同源模建的三维蛋白结构以及分子对接模型,共预测获得27条可能具有潜在ETA拮抗活性的寡肽分子.该文进一步分析关键氨基酸GLN165,并结合文献,说明其对拮抗剂活性的重要性.计算机辅助水解方法可以高效地对已知序列结构的中药蛋白进行模拟水解,结合分子模拟模型,能进一步辨识中药寡肽潜在的生物学活性.该研究为快速、高效开展中药来源的肽类物质的活性机制研究提供了方法学依据.
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肝豆状核变性基因突变的生物信息学分析
目的：分析预测肝豆状核变性（WD）基因突变与蛋白结构、功能改变的关系，为WD的早期基因诊断与治疗提供参考。方法：选取符合Wilson病诊断标准的患者6例及健康对照者6名作为研究对象，用盐析法抽提受试者基因组DNA并进行测序鉴定，检测受试者WD基因突变情况；通过生物信息学分析手段分析预测WD基因的生物学特性及理化性质，对WD基因编码蛋白及发生基因突变的外显子进行同源模建，分析基因突变与其空间构象变化的关系。结果：6例患者中有3例为第8外显子突变（2例为Arg778Leu，1例为Arg778Gln），有2例为第12外显子突变（Thr935Met和Arg919Gly），1例为第7外显子突变（Trp650Ser）；蛋白生物信息学分析发现，蛋白总体带负电荷，不稳定指数45.26，蛋白分子量为157.23kDa，蛋白具有两亲性分子的特点；蛋白有8个跨膜区，二级结构主要有α-螺旋，无规则卷曲，延伸结构及β-转角；同源模建结果显示，778位氨基酸的突变导致外显子8的空间构象发生明显改变；而外显子12的935和919位氨基酸突变则对其空间构象影响不大。结论：778位氨基酸突变或许不是一个温和突变，该位点的突变对本病的发生影响更为深刻。
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SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)蛋白保守氨基酸基序的鉴定
严重急性呼吸综合片冠状病毒(SARS病毒)的高危害性,使得研究其分子机制并开发有效的治疗药物成为当前生物学家面临的紧迫任务.
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基于TNF功能表位设计新型人源单链抗体
目的：开发基于 TNF 功能表位的新型人源单链抗体。方法利用自主研制的鼠抗 TNF-α中和单抗 Z12能特异性识别 TNF-α的141~146位功能表位特性，通过理论模拟构建 TNF/抗体 Z12相互作用的复合物模型设计获得功能性拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）以及单域抗体 PTVH5（以人抗体可变区重链框架 VH5为支架合理展示 PT2、PT3、PT4），利用计算机辅助分子设计以及同源模建、分子对接方法，进一步合理选择人抗体可变区轻链框架（Vκ1）作为展示支架，通过构象判别、作用能比较以及识别区域确认并选择合适的连接肽设计新型单链分子 ScFv_AB1。结果理论分析发现，ScFv_AB1稳定性较好，识别 TNF-α的141~146功能位点（即 Z12识别的位点）。生物学实验证明， ScFv_AB1能与 TNF-α结合、抑制 TNF-α与TNFR 的结合、抑制 TNF-α介导的细胞毒作用。结论初步验证了“借助计算机模建，基于人抗体可变区的框架结构和拮抗肽设计单链抗体分子”的策略是可行的，从而为人源小分子抗体的制备提供了一条可供选择的途径。
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HCV高变区合成多肽的抗原性研究
目的通过计算机同源模建,寻找丙型肝炎病毒高变区(HCV HVR1)中保护性多肽抗原表位.方法计算机同源模建,预测多肽的抗原性,然后用淋巴细胞转化的方法验证其抗原性.结果同源模建与实验结果一致,多肽抗原性有待进一步的提高.结论同源模建是一种高效寻找具有保护性抗原多肽的经济快速方法.
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5-羟色胺1A受体配体发现新思路:基于受体的药效团
5-HT1A是治疗焦虑症、抑郁症和疼痛等精神类疾病的重要靶点.近年来寻找5-HT1A受体配体以及相关药物的发现,一直是研究的热点.本文首先采用同源模建的方法构建了一个5-HT1A受体模型,并通过与MP349进行分子对接研究,得到了一个可靠的受体-配体结合模式.在此基础上,建立了一个基于受体的药效团模型,该药效团模型包含许多配体和受体相互作用的重要特征;并在后续的虚拟筛选实验中验证了这个药效团模型检验真正的5-HT1A受体配体的能力.本研究结果可用于指导今后5-HT1A>配体的合成改造以及新的先导化合物的发现.
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人多药耐药相关蛋白MRP4不同状态的分子模型
ATP结合盒(ABC)转运蛋白中的多药耐药相关蛋白MRP4与多药耐药性的产生有关.多药耐药性的产生对于抗肿瘤和抗感染的治疗是一个很大的挑战.在一些MRP4高表达的肿瘤中,抑制MRP4的作用对影响肿瘤的进程和药物的耐药性都有显著效果.由于MRP4的结构信息非常有限,缺少X-射线晶体结构,同源模建是获得MRP4三维结构的一种有效的方法.我们主要基于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的P-gp,海栖热胞菌(Thermotoga maritima)的ABC转运蛋白TM287/288及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的ABC转运蛋白Sav 1866的结构分别建立了人MRP4的底物摄取态、底物转运态和底物释放态模型.模建的结构进一步进行能量小化和分子动力学模拟优化,经过多种工具和服务器的验证证明了模建结构的合理性和可靠性.这些MRP4的结构可以用来研究MRP4结构和功能的关系,以及设计特定的膜转运蛋白调节剂(MTMA).
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κ阿片受体与拮抗剂作用机制的计算机模拟研究
目的 构建人κ阿片受体三维结构模型,探讨拮抗剂与受体作用机制.方法 应用同源模建方法构建人κ阿片受体三维结构模型,采用Profile-3D和Ramachaadran图验证模型的可靠性.将选择性κ阿片受体拮抗剂5'-GNTI与受体进行分子对接和分子动力学优化,得到拮抗状态κ阿片受体模型.采用AutoDock对接软件将受体与测试集拮抗剂进行分子对接研究.结果 搜寻和分析受体的活性位点,确定合理的κ阿片受体结合口袋.训练集和测试集化合物与受体对接的结合自由能AG和实际活性lgK之间具有较好的相关性,相关系数为0.779,各类拮抗剂与受体结合的关键氨基酸残基与实验结果基本一致.说明本研究构建的拮抗状态受体模型比较合理.结论 建立了合理的κ阿片受体模型和拮抗状态受体模型,探讨各类拮抗剂与κ阿片受体的作用机制,为设计新型选择性κ阿片受体拮抗剂奠定理论基础.
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SARS冠状病毒主要蛋白酶结构模建及活性部位运动性分析
SARS冠状病毒3CL蛋白酶是病毒复制过程中的关键酶,有可能成为针对抗SARS药物研制的重要靶标.利用同源模建的方法建立了SARS冠状病毒3CL蛋白酶的结构模型,对于二聚体中蛋白质分子间相互作用分析表明该蛋白在溶液中有可能形成二聚体.利用分子动力学与多正则系综采样相结合的方法对于SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性部位的两个环区进行了构象模拟,找到了两种代表性构象,预示着SARS冠状病毒3CL蛋白酶在催化过程中有可能伴随着构象变化.
关键词： SARS冠状病毒3CL蛋白酶 同源模建 二聚体 构象变化 -
抗感染药物作用新靶点CrtN蛋白的结构及其与抑制剂萘替芬的作用机制研究
目的:研究抗感染药物作用新靶点CrtN的结构及其与抑制剂萘替芬的作用机制,为新型CrtN抑制剂的发现奠定基础.方法:采用同源模建获得CrtN的三维结构,然后用分子动力学方法优化初始结构,并用Ramachandran图评估结果,后通过活性位点搜索、分子对接和动力学模拟研究抑制剂萘替芬与CrtN的作用模式.结果:通过同源模建和动力学优化获得合理的CrtN结构用于药物与靶点的相互作用研究.对CrtN进行活性位点搜索,确定Site4口袋作为萘替芬的结合位点.通过分子对接及动力学模拟发现萘替芬与M51、P53、I55、I85、P146、Y150、Y190、L311、L376等形成疏水作用,与Y354形成阳离子-π键作用.结论:首次对CrtN的三维结构进行研究,阐明了疏水和阳离子-π键作用是萘替芬对CrtN产生抑制活性的重要分子基础.
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基于FKBP52结构的药物发现:2-氮-双环[2.2.1]庚-5-烯-3-羧酸衍生物的设计、合成及其神经营养活性
目的 设计并合成具有神经营养活性的小分子化合物.方法 同源模建FKBP52的N-端3D结构,基于模建的3D结构设计并合成2-氮-双环[2.2.1]庚-5-烯-3-羧酸衍生物.结果与结论 合成了21个目标化合物.结果显示化合物10k具有明显的促神经生长作用.
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巴曲酶的线性和构象型B细胞抗原表位的预测
目的:预测巴曲酶的B细胞线性表位和构象型表位,本项目的预期成果可为该药物的安全化应用提供新思路.方法:基于巴曲酶的蛋白质序列,采用DNAStar软件和ABCpred、BCPREDS、BcePred和BepiPred 1.0服务器预测巴曲酶的线性表位.以蝮蛇毒蛋白C激活剂蛋白的晶体结构为模板,利用MODELLER9.10软件中的Pythonwin程序进行该酶的同源模建,并利用PROCHECK、ERRAT及PROSA程序进行合理化评价.根据巴曲酶的模建三维结构并结合DiscoTope和cons PPISP网络数据库预测构象型抗原表位.结果:得到肽端AA3~9、19~31、57~82、93~101、106~114、127~142、171~183、196~208、223~230区域为巴曲酶的B细胞线性表位优势区域.然后得到蛋白的N端41~48、57~71、76~82、93~100、109~115、127~133、146~152、194~203区段为B细胞构象型表位区域.结论:这些B细胞抗原表位可为降低巴曲酶的免疫原性提供实验依据.
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基于同源模建技术的抗肝癌单链抗体人源化抗体库设计
目的：完成抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的人源化设计，为进一步构建人源化抗肝癌噬菌体单链抗体库奠定基础。方法通过IgBlast搜索基因数据库获取鼠源抗体序列模板，从蛋白质晶体结构数据库获得结构模板；在 SGI图形工作站上，通过 InsightlⅡ软件包进行抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构模建，分析抗体氨基酸序列和分子结构，确定影响抗原结合部位的框架区关键残基。结果成功模建抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构，确定AAW67378、BAB18257分别为单链抗体scFv DM的重链和轻链框架区佳人源化模板，确定了人源化残基、回复突变的残基，将可能影响抗原结合位点结构的残基的鼠源和人源副本编入到人源化抗体库序列中。结论计算机辅助下的同源模建技术可为抗体人源化设计提供方案，为抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM同步实现人源化和优化提供可能性。
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风疹病毒E1蛋白与受体结合特定结合域的预测
目的 同源模建E1蛋白及其受体髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)的三维结构,应用分子对接的方法预测E1蛋白与其受体MOG的候选结合氨基酸残基.方法 采用MODELLER程序预测E1蛋白及其受体MOG的三维结构,并应用CASTp server进行活性口袋的预测;采用ProtScale进行疏水性分析,应用基于隐马尔可夫模型(HMM)算法的SMART程序搜索蛋白序列的motif;采用PyMOL-APBS软件设计E1蛋白及其受体MOG分子的腔介质结构,分析其表观静电势,应用PLATINUM程序进行分子对接,寻找其结合位点.结果 E1蛋白由3个结构域组成,其中D1、D3处于结构的底部,形成一个大的口袋,C-末端与D2的一侧形成另一个大的口袋,其余口袋主要集中在D2上半部的融合面中;MOG的结构模型为8个反平行的β折叠组成的一个β折叠桶,预测结构的主链构象的所有氨基酸均处于允许区.在MOG N-末端1～17位的氨基酸残基形成一个motif(low complexityregion),46～ 127位的氨基酸残基形成了一个motif V型免疫球蛋白样结构域(Immunoglobulin V-Type,IGv);lowcomplexity region段氨基酸残基表现为强疏水性.MOG N-末端的5个残基基序及ARG101 ～ GLU107构成的β转角共同形成一个突起的结构,插入到E1蛋白的活性口袋中,与口袋中的ALA86、TYR90、TYR101、PHE102、ASN103、GLY 105、SER107、TYR109、ALA122、PHE123、HIS125、SER 126相互结合.结论 应用计算机模拟技术预测了E1蛋白与其受体MOG结合的特定结合域,为今后进一步研究其相互作用奠定了基础.
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嗜酸氧化亚铁硫杆菌的谷胱甘肽还原酶的结构模建和底物分子对接
极端环境微生物嗜酸氧化亚铁硫杆菌的谷胱甘肽还原酶(GR)可能在它的抵抗极端酸性,有毒和氧化性的生物浸出环境中发挥至关重要的作用.通过同源模建技术和分子动力学模拟,它的一个三维结构被构建,优化和检验了.获得的结构被进一步用于搜索绑定位点,跟辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和底物谷胱甘肽(GSSG)进行分子柔性对接,并以此识别关健残基.对接结果显示,位于活性残基Cys42和Cys47之间的二硫键夹在FAD的活性位点和底物GSSG的二硫键之间.它们之间的距离非常靠近,这跟底物反应机理的初始步骤的情况十分一致.相互作用能表明8个酶中残基Cys42,Cys47,GIu443B,Glu444B,His438B,Ser14,Thr447B和Lys51是固定或激活GSSG的关键残基,这跟以前的实验事实相吻合.此外,根据相互作用能我们还新发现7个重要残基(Arg449B,Pro439B,Thr440B,Thr310,Va143,Gly46 and Va148).所有这些残基在其它物种中的相应物中也都是保守的.这些结果有助于进一步的实验研究和理解其催化机理,进而揭示这种细菌的抗毒机理,服务于工业应用.
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结核分枝杆菌H37Rv色氨酸合成酶α亚基编码基因的克隆、表达及酶学性质分析
目的 克隆表达色氨酸合成酶α亚基编码基因并对其进行功能分析.方法 以结核分枝杆菌(简称结核杆菌)H37Rv基因组为模板,扩增trpA基因,构建pET30a-trpA重组质粒;转化重组质粒到大肠埃希菌DH5α并在BL21(DE3)诱导表达,纯化可溶性的结核杆菌重组色氨酸合成酶α亚基(His-rMtTrpA).十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和质谱分析测定相对分子质量(Mr)后,用圆二色光谱(CD)分析和同源模建方法检测二级和三级结构.研究不同浓度His-rMtTrpA对β亚基酶活反应的影响.结果 成功克隆了813 bp的目的 基因trpA,并获得了高纯度的His-rMtTrpA蛋白.重组蛋白Mr为33.151×103(含载体蛋白).25℃时His-rMtTrpA的二级结构包括31.8%α螺旋、31.8%β折叠、8.4%β转角和27.9%无规则卷曲,它的三维模型显示为(β/α)8桶状结构.酶学性质研究表明,在His-rMtTrpA与MtTrpB的摩尔比为2.2时,色氨酸合成酶α亚基可以大限度促进β亚基酶活反应.结论 成功得到高纯度的重组目的 蛋白His-rMtTrpA,其功能分析为针对色氨酸合成酶的药物筛选设计提供理论基础.
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抗CD20人源化抗体的制备及生物学活性鉴定
在前期实验中,我们制备了一株抗CD20的嵌合抗体c8F6并证实其可有效杀伤CD20阳性的B淋巴瘤细胞.为了进一步降低c8F6的免疫原性,在研究中我们采用同源模建的方法模拟8F6的三维结构,通过分析其空间结构,确定可能影响抗体与抗原结合的框架区(FR)氨基酸残基,然后将鼠源抗体互补决定区(CDR)和FR区的关键氨摹酸移植到人源模板上,构建出人源化抗体hu8F6.此人源化抗体除cDR区外,仅含有11个鼠源残基,但具有与嵌合抗体相似的亲和力和特异性.体外生物学功能实验进一步表明,hu8F6具有与c8F6相似的补体依赖的细胞溶解作用(CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),可有效杀伤人B淋巴瘤细胞Raji和Daudi,提示hu8F6有望发展成为一个用于B淋巴瘤治疗的低免疫原性抗体制剂.
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蛋白质结构与功能研究中的分子模拟技术
分子模拟技术为蛋白质的研究提供了一种崭新的手段,在理论上解决了结构预测和功能分析以及蛋白质工程实施方面所面临的难题.它在蛋白质的结构预测和模建工作中占有举足轻重的地位,实现了生物技术与计算机技术的完美结合.本文简要阐述了该技术的基本步骤和工作原理,并以目前应用广的生物大分子领域的商品化分子模拟软件Accelrys公司基于Linux系统开发的Insight Ⅱ为例,介绍了相关程序模块的功能和作用,同时结合该技术在蛋白质的结构预测和模建、结构与功能关系分析、分子设计等过程中的开发与应用,加以具体说明和展望.
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计算机模建和点突变分析抗人CD40单克隆抗体5C11识别的抗原表位
目的:通过计算机模拟与点突变实验初步探讨本课题组前期研制的抗人CD40激发型单克隆抗体5C11识别的抗原表位.方法:利用InsightⅡ软件分别模拟抗原、抗体结构,构建抗原抗体复合物模型,通过计算推测5C11单抗所识别的抗原表位.构建人野生型CD40( wtCD40)及其第70位苏氨酸突变型(70muCD40)和第114位谷氨酸突变型(114muCD40)的重组真核表达载体pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40,脂质体转染法将重组载体导入HEK293细胞,筛选稳定转染细胞株(即HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞).流式细胞术和Western blotting 检测5C11单抗与HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞的结合能力.结果:成功构建plRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40真核表达载体和相应稳定转染细胞株.5C11单抗与HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞结合能力较HEK293/wtCD40细胞明显减弱；Western blotting检测结果表明,5C11单抗仅识别HEK293/wtCD40细胞,不识别HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40细胞.结论:人CD40氨基酸序列的第70位苏氨酸和第114位谷氨酸是其单抗5C11识别的抗原表位,对构建人源化CD40抗体具有潜在的临床意义.
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Bcl-2蛋白与Bak蛋白肽片段复合物的三维结构模建与分析
目的:探讨抗肿瘤药物新靶点Bcl-2蛋白与底物蛋白的相互作用.方法:以同源模建的方法构建Bcl-2蛋白与底物Bak蛋白的肽片段的复合物的三维结构,并对此结构模型的合理性进行验证.比较复合物结构模型中Bcl-2的活性腔与自由状态结构的差异,分析它与底物肽相互作用的重要位点和残基,并计算它与两类抑制剂的分子对接.结果:构建的Bcl-2复合物结构模型合理,通过比较发现模建的结构模型中活性腔特别是α3前后的部位与自由状态有较大的结构变化,蛋白活性腔侧部的一些酸性碱性极性残基及底部的一些疏水残基对于结合底物蛋白并发挥功能非常关键,这些结果与生物学残基突变实验数据得到了较好的相互验证.结论:本研究构建了合理的Bcl-2蛋白与底物Bak蛋白肽片段的复合物的三维结构.
