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通过基因突变提高噬菌体蛋白Ⅷ介导的抗体Fab段的展示
目的构建基因Ⅷ变种文库,筛选表面展示效率高的突变体,改进抗体分子在噬菌体表面的呈现效果.方法通过重叠PCR,在基因Ⅷ引入随机突变,克隆到抗乙肝表面抗原(HBsAg)的噬菌体抗体表达载体中,使抗HBsAg的Fab段通过蛋白Ⅷ展示于噬菌体表面,构建蛋白变种Ⅷ文库,筛选能使HBsAg表面呈现效果得到提高的蛋白Ⅷ突变体.结果构建了一个库容为6×108的基因Ⅷ变种文库,使用游离抗原竞争、硫氰酸盐洗涤等方法进行淘筛,获得多个展示活性高于野生型蛋白Ⅷ的突变体,其中2个好的变种可使表面呈现效果提高50～70倍.结论通过对基因Ⅷ的改造可提高其对抗体Fab段的展示性能,获得2株可使展示活性提高50～70倍的基因Ⅷ突变体.
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噬菌体随机十肽库的构建
目的采用丝状噬菌体表达载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十肽库.方法人工合成编码随机十肽的寡核苷酸片段及两条分别有SfiI和NotI酶切位点的引物,通过PCR反应得到其双链片段,将其克隆入载体pHEN1中,将重组产物转化入大肠杆菌TG1,构建成随机肽库.结果所建肽库含1×109个集落形成单位(cfu).随机挑取8个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机.结论成功构建了有较高库容量的噬菌体随机十肽库.
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新基因结构与功能研究的策略
发现一种新的基因,同时把其编码的新蛋白的结构与生物学功能、与生物学和临床医学之间的相互关系、以及新基因表达调节的机制阐明,是目前基因的分子生物学研究领域中具挑战性的工作.首先利用酵母双杂交(yeasttwo-hybrid)技术、酵母单杂交技术(yeast one-hybrid)、抑制性消减杂交(SSH,suppression subtractive hybridization)技术、基因芯片(DNA chip)技术、噬菌体表面展示(phagedisplay)技术等获得蛋白结合蛋白的编码基因、差异表达的基因、DNA/RNA结合的蛋白基因等,或利用生物信息学技术获得推测的编码基因.然后,利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合的手段,阐明新基因的功能、基因表达启动子的结构和调节机制基础,终阐明新基因的结构和新蛋白的生物学功能,以及这种基因研究的可能临床医学意义.生物信息学技术与分子生物学技术的结合,是目前基因的分子生物学研究领域中的重要、有效的研究技术和方法.
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噬菌体表面展示技术及其在靶向载体构建中的应用
目的 介绍噬菌体表面展示技术及其在靶向载体构建中的应用.方法 主要综述了近年来国内外的相关文献.结果 采用噬茵体表面展示技术可以高通量筛选单链抗体等靶向分子,将其连接至携载药物或基因的非病毒及病毒载体可提高其靶向性及产生更好的治疗效果.结论 噬茵体表面展示技术的发展和成熟将为构建具有高效、特异性的靶向载体提供条件.
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噬菌体表面展示人干扰素-α 2b
目的:建立一种研究人干扰素-α结构与功能的新平台.方法:利用噬菌体表面展示(phage display)技术表达人干扰素-α 2b(hIFN-α 2b)基因.结果:生物活性测定表明,3×108 TU重组噬菌体干扰素的抗病毒活性与5 IU基因工程IFN-α 2a的活性相当,并能被IFN-α单抗中和.结论:hIFN-α 2b在噬菌体表面能正确折叠和功能性表达,即成功地建立了噬菌体展示外源肽(hIFN-α)的技术平台.
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噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
1985年,Smith GP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1].1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库.1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3].这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响.
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MUC1黏蛋白模拟表位的筛选和原核表达
目的从噬菌体随机12肽库中筛选出MUC1抗原的模拟表位,构建MUC1模拟表位的原核表达载体.方法通过生物淘洗、基因测序和氨基酸序列比较,筛选出模拟表位,构建重组表达质粒PET-31b(+),用IPTG诱导表达,亲和层析纯化,Western blot鉴定其抗原性.结果筛选到的模拟表位与MUC1单克隆抗体的亲和力较强.成功构建了重组表达质粒,重组蛋白在BL21(DE3)plysS中得到诱导表达,纯化的目的蛋白在SDS-PAGE上呈现特异的单一条带,Western印迹也检测到目的蛋白特异条带.结论筛选到了MUC1的模拟表位,成功表达和纯化了MUC1模拟表位蛋白,为研究其在肿瘤疫苗方面的应用奠定基础.
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MUC1黏蛋白模拟表位的筛选和鉴定
目的从噬菌体表面展示的随机12肽库中筛选出MUC1抗原的模拟表位.方法通过生物淘洗,获得阳性噬菌体克隆,通过基因测序,推导氨基酸序列,同MUC1核心序列比较,选出2个模拟表位,进行抗原表位预测和竞争抑制实验.结果筛选到的两个模拟表位与MUC1单克隆抗体的亲和力均较强,能特异性抑制MUC1的抗原抗体结合,且包含有与某些MHCⅠ类分子较好结合的位点.结论从噬菌体12肽库中筛选出两个MUC1的模拟表位可以作为靶向MUC1肿瘤疫苗的候选肽.
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羟磷灰石结合蛋白和小分子多肽的研究进展
羟磷灰石(HA)是骨组织和牙体硬组织中的主要无机成分,在生物体内存在多种能与HA结合的蛋白质.一些蛋白质能特异性地识别HA晶体表面的某些特殊结构,并在生物矿化过程中扮演重要角色.近年来,通过分子模拟技术和分子生物学技术相结合的方法,人们采用噬菌体表面展示技术对有机-无机界面的分子识别进行了研究,极大地推动了HA结合小分子多肽的分离和界面识别机制研究,HA结合的小分子多肽在生物矿化调控和新材料合成方面展现了广泛的应用前景.下面就HA结合蛋白和小分子多肽的研究进展作一综述.
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从噬菌体表面展示肽库中筛选衣原体单克隆抗体识别的抗原表位
利用抗体捕获法,经三轮淘洗,从表面展示随机肽序列的噬菌体文库中筛选到与衣原体单克隆抗体C17特异结合的噬菌体克隆,其一致序列为:(L/I)PGGS(P/W),竞争抑制实验表明含特异序列的克隆能与天然抗原竞争.据此,我们认为此序列为衣原体的B细胞抗原表位.
