首页 > 文献资料
-
与卵巢癌细胞表面受体特异性结合的多肽片段研究
目的从噬菌体随机肽库中,筛选与卵巢癌细胞特异性结合的多肽片段,为卵巢癌靶向治疗提供实验基础.方法从噬菌体随机肽库中,依次筛选4株卵巢癌细胞株及正常卵巢细胞,并获得阳性克隆,再经过酶联免疫吸附实验挑选出目的克隆,进行DNA测序及同源性分析.结果将获得的10个目的克隆,进行DNA序列分析,得到1段可以与卵巢癌细胞结合的特异性多肽片段(YYGLAEVDAGGS).结论噬菌体随机肽库为卵巢癌细胞表面靶位的筛选提供了高效、快捷的筛选体系,实验所获得的特异性多肽片段,有望成为卵巢癌靶向治疗的有效位点.
-
表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响
目的探讨表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响.方法选取卵巢癌细胞株A2780、SKOV3,分别与特异性的噬菌体共同作用,通过台盼蓝拒染法、流式细胞仪、平板克隆形成实验、四甲基偶氮唑蓝比色法、Boyden小室体外侵袭实验等方法,检测卵巢癌细胞生物学行为的变化.将A2780、SKOV3细胞按实验目的分别分为3组:(1)实验组,加入可与卵巢癌细胞特异性结合的噬菌体(阳性噬菌体);(2)空白对照组,不加噬菌体;(3)阴性对照组,加入不与卵巢癌细胞结合的噬菌体(阴性噬菌体).结果实验组、阴性对照组和空白对照组的平均活细胞比例分别为(72.1±6.2)%、(84.8±4.6)%和(93.1±2.5)%,与阴性对照组及空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的凋亡率分别为20.39%和43.99%,而阴性对照组均未见凋亡峰的出现;实验组细胞的平均克隆形成率为4%,阴性对照组为15%,空白对照组为15%,实验组与阴性对照组及空白对照组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的生长抑制率分别为11.07%和9.58%,均明显高于各自的阴性对照组(分别为2.05%和1.09%),与各自的阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的侵袭指数,都低于各自的阴性对照组和空白对照组,分别与各自的阴性对照组和空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论筛选出的特异性噬菌体对卵巢癌细胞的生长、增殖和迁移有一定的下调作用,与噬菌体结合的卵巢癌细胞表面受体可能与肿瘤的发生和转移有关.
-
随机十二肽噬菌体展示文库筛选血型B抗原模拟多肽的实验研究
目的:筛选出替代血型B抗原的模拟多肽,用多肽抗原替代糖类抗原.方法:抗血型B抗原的单克隆抗体作为固相筛选靶分子,对随机十二肽噬菌体展示文库进行生物淘选(bio-panning),经包被-结合-洗脱-扩增等循环3轮,对筛选的克隆ELISA鉴定,并通过剂量依赖实验验证其结合特异性.后提取DNA测序,确定模拟肽氨基酸序列.结果:3轮筛选结束,得到2个亲和力较强的十二肽序列TKNMLSL-PVGPG和HSLKHTQMSYSS.结论:经过生物筛选得到模拟多肽序列,利用噬菌体展示技术筛选糖类抗原的模拟肽具有可行性,为糖类抗原的研究提供一种新思路.
-
肾癌T7噬菌体展示肽库构建的实验研究
目的:构建肾细胞癌T7噬菌体展示肽库,为下一步筛选肾癌早期诊断分子标志群打下基础.方法:用传统Trizol方法分别抽取31例涵盖各种组织类型肾癌组织标本的总RNA,确定完整性后再根据OD值等量混合总RNA,用试剂盒完成mRNA的分离并电泳检测其质量,经反转录、末端平齐、片段长短筛选、加接头、双酶切、去除多余接头和<300 bp的cDNA片段等步骤,再与T7Select10-3b载体连接、体外包装并扩增得到肾癌T7噬菌体展示cDNA文库.通过铺平板测定和PCR技术鉴定所建文库质量.结果:建成原始文库的库容量为5.0×107 pfu/mL,扩增后文库滴度为3.5×1012 pfu/mL,重组率为95%,插入片段为300～2 000 bp.结论:成功用T7噬菌体构建了高质量的肾癌cDNA文库,为筛选可用于临床早期诊断的肾癌特异标志奠定基础.
-
从随机肽库中筛选血管内皮生长因子的抑制剂
目的从随机噬菌体肽库中筛选血管内皮生长因子(VEGF165)的抑制剂,研究治疗实体瘤生长的小分子药物.方法以VEGF165分子的受体KDR为靶分子,筛选随机噬菌体环7肽库,通过竞争性洗脱得到能特异结合KDR的阳性噬菌体,以ELISA、细胞免疫组化、细胞ELISA、鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和MTT法,鉴定其结合活性和抑制活性.结果得到5个能特异结合靶分子的阳性噬菌体克隆,它们均可以与表面有KDR表达的细胞结合,其中噬菌体克隆3和13还能抑制VEGF165诱导鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成的活性.但MTT法结果显示,这两种噬菌体小肽对高表达KDR的阳性细胞生长没有明显的抑制活性.结论从随机噬菌体肽库筛选到了能抑制VEGF165生物活性的克隆,为进一步研究小分子抑瘤药物提供了一定基础.
-
高转移潜能卵巢癌靶向肽的筛选及其对卵巢癌生物学行为的影响
目的 探讨高转移性人卵巢癌细胞HO8910PM特异性结合短肽对卵巢癌生物学行为的影响.方法 以HO8910PM细胞为靶细胞,人正常卵巢上皮7311细胞和卵巢癌HO8910细胞为吸附细胞,用噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光染色法对阳性噬菌体克隆进行鉴定.建立特异性短肽裸鼠腹腔移植瘤模型,分析其对裸鼠成瘤能力及侵袭、转移能力的影响.采用免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡指数(AI).结果 经过4轮筛选后,噬菌体在HO8910PM细胞上出现了明显的富集现象.ELISA结果显示,在随机挑选的20个噬菌体克隆中,有12个可与HO8910PM细胞特异性结合.细胞免疫荧光显示,筛选的阳性噬菌体克隆能与HO8910PM细胞特异性结合.黏附实验结果显示,HO8910PM-peptide20组、HO8910PM-peptide16组和HO8910PM组的细胞黏附率分别为49.0％、96.8％和100.0％,HO8910PM-peptide20组与HO8910PM组的细胞黏附率差异有统计学意义(P＜0.05),合成的特异性短肽序列peptide20(THRVHLH)能明显抑制HO8910PM细胞的黏附能力.裸鼠体内实验显示,peptide20能够有效地抑制肿瘤的生长和转移,实验组、阴性对照组和空白组裸鼠移植瘤组织中VEGF蛋白的阳性表达率分别为21.2％、81.4％和85.7％,实验组的VEGF蛋白阳性表达率低于阴性对照组和空白组(P＜0.01);而实验组、阴性对照组和空白组的AI分别为(18.21±2.49)％、(3.76±1.77)％和(4.78±1.57)％,实验组的AI明显高于阴性对照组和空白组(P＜0.01).结论 成功筛选到高转移性卵巢癌HO8910PM细胞特异性结合短肽,其能够有效地抑制卵巢癌细胞的生长、侵袭和转移,为卵巢癌的药物靶向治疗提供了理想的载体.
-
利用体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性结合肽
目的筛选人源肝癌组织特异性结合短肽.方法体外培养人源肝癌细胞株BEL-7402,建立荷瘤裸鼠模型.尾静脉注射噬菌体12肽文库至荷瘤裸鼠体内,循环20 min后回收肿瘤组织中噬菌体,同时取正常对照组织进行噬菌体效价测定和免疫组化观察.将回收的噬菌体扩增、纯化,并以此作为起始物进行下一轮筛选.经过3轮体内筛选,得到与肝癌组织或细胞特异结合的肽段.随机挑选噬菌体单克隆进行测序,分析序列同源性后进行体外细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)和体内回输实验,验证噬菌体克隆的导向性.结果经过3轮体内筛选,瘤组织中噬菌体的回收率逐步提高,回收量随着输入量的增加迅速增加,而每轮筛选肝组织中的噬菌体回收量始终保持在一个恒定范围,并不随输入量的增加而增加.免疫组化结果显示,第3轮筛选后,瘤组织中的噬菌体得到高水平富集,同时其他组织的非特异性结合降至低.肝癌细胞特异性结合强的是A54号单克隆,A67、B2号单克隆次之.B2的导向效果好,A54次之.通过对噬菌体单克隆的序列分析,初步确定了PSS/PTT基序.结论利用体内噬菌体展示技术,可以成功筛选到与肝癌细胞或组织特异结合的噬菌体肽.
-
VCAM-1核心表位的噬菌体短肽用于EAE的实验性治疗
目的获得VCAM-1的拮抗物,用其对EAE进行实验性治疗. 方法用鼠抗人VCAM-1单抗筛选噬菌体15肽库,经4轮亲和筛选后进行ELISA鉴定,对得到的两株强阳性克隆进行测序,用其免疫豚鼠制备抗血清,观察对EAE发病临床级别的影响. 结果强阳性克隆小肽顺序为IRRNPIPKTIKTI(M)LI,并获得了VCAM-1的抗血清,该克隆可延缓EAE发病,且可降低临床分类级别. 结论此噬菌体短肽可作为VCAM-1的拮抗物延缓EAE模型鼠的发病.
-
噬菌体肽文库筛选人成骨细胞特异性结合多肽的实验研究
目的 探讨噬菌体肽文库筛选人成骨细胞特异性多肽的实验方法,为钛种植体表面生物化修饰提供实验基础.方法 以人颅骨成骨细胞为靶细胞对噬菌体十二肽文库进行筛选,将获得的表面和内化两部分噬菌体分别培养,以人牙龈成纤维细胞为对照细胞,进行酶联免疫吸附测定,免疫荧光鉴定阳性噬菌体克隆并测序.结果 4轮筛选后,根据随机数字表随机挑选的噬菌体克隆中22个鉴定为阳性克隆,提取其单链DNA进行测序分析,其中出现频率高(14次)的特异性多肽氨基酸序列为MGWSWWPETWPM.结论 利用噬菌体肽文库可成功筛选获得与成骨细胞特异性结合的多肽,为构建成骨细胞特异性识别的钛种植体表面提供实验基础.
-
一种用于上调内源性人SOD1表达多肽筛选的随机文库及细胞系的构建
目的 以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为示踪物,建立一种简便、经济、有效的随机多肽文库,为进一步筛选出可上调内源性人SOD1表达多肽的药物奠定基础.方法 采用点突变技术,在pET-14b-His-Tat-EGFP载体多克隆位点Xho I之后插入12个随机多肽的36个随机碱基序列.用阳离子脂质体Lipofectamine~(TM) 2000包裹已构建的重组质粒pDsRed1-1-SOD1p后.转染NIH/3T3细胞,荧光显微镜观察SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的表达.用G418筛选稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的细胞系,荧光显微镜检测红色荧光蛋白的表达及定位.结果 在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库理论上至少包含了107个独立克隆,且几乎所有克隆插入的随机片段都是36个碱基.稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞质及细胞膜上均有携带SOD1启动子的红色荧光蛋白的表达.结论 成功建立随机多肽表达文库,获得了稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的NIH3T3细胞系.
-
噬菌体肽库研究进展
噬菌体肽库是将一段编码外源短肽的寡聚核苷酸整合到噬菌体基因中,以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达,从而构建成序列不同的特定长度的小肽集合.一般采用生物亲合选择系统淘选噬菌体肽库.随着此项技术的不断完善和发展,噬菌体肽库已在许多领域得到了广泛的运用.
-
修饰性肽配体的作用机制、应用及筛选进展
修饰性肽配体是在抗原表位的基础上对表位进行氨基酸改造形成的具有免疫调节活性的短肽,已经在治疗自身免疫疾病、恶性肿瘤和病毒感染等疾病方面显示出良好的应用前景.一方面,修饰性肽配体可通过影响天然抗原表位、主要组织相容性复合体和T细胞受体形成的三分子结构发挥特异性免疫调节作用;另一方面,修饰性肽配体还可通过改变抗原呈递细胞内信号、旁路抑制和激发异源性免疫反应等机制发挥治疗作用.结合使用噬菌体展示技术对肽库进行筛选,可获得大量高特异性和高亲和力修饰性肽配体.修饰性肽配体作为潜在抗原特异性药物的重要来源正在受到广泛关注.
-
肿瘤干细胞表面标记物CD133高亲和结合肽的筛选
目曲:应用噬菌体肽库技术筛选肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合短肽,为干细胞研究、肿瘤治疗及抗肿瘤转移研究提供新的技术和工具.方法:利用链霉亲和素与生物素的高度亲和力,以生物素标记的鼠CD133细胞外段(bio-CD133)为靶,对噬菌体七肽库进行液相筛选,应用夹心ELISA选择出结合较强的克隆,提取DNA并测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性.结果:通过三轮体外液相筛选,得到结合能力较强的高亲和结合肽,5条完全一致的重复序列为APSPMIW和3条完全一致的重复序列为LQNAPRS,竞争性阻断实验证实其特异性较强.结论:利用噬菌体肽库技术成功地筛选出具有较高亲和力和特异性的CD133结合肽,表明以生物素标记的小分子多肽为靶筛选结合肽的技术具有可行性.
-
利用噬菌体随机肽库技术分析丙肝患者血清中抗HCV抗体的表位
目的:分析患者血清中抗HCV抗体的抗原表位.方法:用Protein A亲和层析柱从患者血清中纯化、制备抗HCV多克隆抗体;以此对噬菌体表面展示的随机6肽库进行亲和筛选.结果:经具有良好富集效果的三轮筛选后,从第三轮挑选出的12个克隆进行结合试验,发现8个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清反应;测序表明阳性克隆的外源肽具有一定的相似性.用阳性噬菌体克隆检测20例患者血清,有程度不等的阳性反应.结论:用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中筛选得到了有一定功能的模拟表位.
-
丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗原模拟表位的筛选和鉴定
目的:筛选丙肝病毒(HCV)包膜蛋白(E2)特异性噬菌体模拟表位.方法:以抗-HCV E2的单克隆抗体作为固相筛选分子,对噬菌体随机七肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,随机挑取50个克隆,经酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定、交叉反应以及竞争抑制性实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV E2抗原的模拟表位.结果:经噬菌体富集后,得到12个阳性克隆,确定氨基酸序列XXPXYXW为HCV E2的模拟表位.结论:用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV E2的模拟表位,为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.
-
与胃癌腹膜高转移细胞表面受体特异性结合的多肽片段的研究
目的利用噬菌体随机肽库筛选与胃癌腹膜高转移细胞特异性结合的多肽,为肿瘤细胞的靶向性治疗筛选药物和载体.方法利用噬菌体随机十二肽库对人胃癌细胞系GC9811和其腹膜高转移亚系GC9811-P进行3轮差异筛选、富集,获得与胃癌腹膜高转移细胞亲和的噬菌体克隆.酶联免疫吸附实验(ELISA)测定其与GC9811-P和GC9811细胞的亲和力,提取阳性噬菌体DNA并进行DNA序列测定,获得与胃癌腹膜高转移细胞亲和的多肽序列并予合成.利用荧光染色和流式细胞仪鉴定噬菌体克隆和合成肽与胃癌腹膜高转移细胞的体内外的结合特异性.结果筛选及ELISA结果显示得到与GC9811-P细胞特异性结合并内化入癌细胞的噬菌体克隆,测序结果示45%的被检噬菌体展示相同的多肽序列SMSIASPYIALE,推测SMSI是胃癌腹膜高转移细胞特异性结合肽的基序.合成的多肽与细胞共孵育48 h或多肽药物浓度达5 μmol/L时,显示出明显的结合能力.平均荧光强度分别为17.19±0.42和16.89±0.31(每组实验为3个样本均值),与对照组无关肽PC的平均荧光强度(4.33±0.53)比较,差异有统计学意义(P＜0.01).合成的多肽与细胞共孵育72 h或多肽药物浓度达10 μmol/L时细胞的平均荧光强度为23.58±0.71和24.95±0.15(每组实验为3个样本均值),与对照组无关肽PC的平均荧光强度(4.16±0.24)比较,差异有统计学意义(P＜0.01).裸鼠体内试验说明合成的多肽可与GC9811-P细胞成瘤的组织结合而不与GC9811及其他细胞成瘤的组织结合.结论筛选噬菌体随机肽库获得能与胃癌腹膜高转移细胞特异性结合的多肽序列SMSIASPYIALE;合成的多肽与胃癌腹膜高转移细胞有特异亲和力,为进一步临床胃癌早期腹膜转移诊断和治疗提供高度特异性和敏感性的理想标志物和靶向载体.
-
血管内皮生长因子受体Flt-1结合小肽抑制肿瘤生长的实验研究
目的检测从十二肽库中筛选获得的能与血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Flt-1结合的小肽的生物学活性.方法免疫细胞化学方法检测小肽融合蛋白DHFR-F56/F90与人脐静脉内皮细胞的结合活性;鸡胚尿囊膜血管增生抑制实验检测DHFR-F56/F90能否抑制鸡胚新生血管形成;裸鼠成瘤实验检测DHFR-F56/F90对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制;免疫组织化学方法检测DHFR-F56/F90能否定位于肿瘤组织.结果小肽融合蛋白DHFR-F56/F90能与人脐静脉内皮细胞结合,DHFR-F56能抑制鸡胚尿囊膜新生血管的形成,且DHFR-F56能与肿瘤细胞结合,促进肿瘤组织坏死及显著抑制肿瘤生长.结论十二肽F56是VEGF结合Flt-1的有效拮抗剂,具有抑制VEGF诱导的新生血管形成而抗肿瘤生长和转移的潜在应用前景.
-
角质细胞生长因子噬菌体活性肽的构建及其对表皮细胞增殖的作用
目的 构建展示角质细胞生长因子(KGF)噬菌体活性肽,检测其促表皮细胞增殖的作用.方法 选择4个KGF序列,设计引物；用反转录-PCR法获得3个KGF序列(P1、P2和P4),直接合成1个KGF序列(P3)；将KGF序列亚克隆至噬菌粒pComb3中；用噬菌体展示技术,将KGF基因片段展示于噬菌体表面；用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测KGF噬菌体活性肽促表皮细胞增殖的作用,测定其在570 nm的吸光度(A)值,用免疫荧光法检测其细胞亲和力.结果 获得4种KGF基因,构建在噬菌粒pComb3中；通过噬菌体展示技术将其表达于噬菌体的表面.MTT检测的吸光度(A)值结果显示阴性对照组(0.293±0.017)与KGF对照组(0.520±0.043)及4种KGF噬菌体活性肽组(P1 ～ 4) (0.469±0.057、0.441±0.048、0.438±0.035、0.446±0.037)间差异均有统计学意义(均P＜0.01),免疫荧光检测结果显示KGF和4种KGF噬菌体活性肽与表皮细胞具有较好的亲和力.结论 构建展示的KGF噬菌体活性肽能够显著促进表皮细胞增殖.
-
噬菌体展示肽库技术在肿瘤诊治研究中的应用
噬菌体展示肽库技术是将高度多样性的多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达,呈现于噬菌体表面的多肽具有相对独立的空间结构,能与配体结合,从而筛选特异性分子表位,其已成为肿瘤诊治研究的重要手段和有力工具.筛选与肿瘤细胞或血管表面细胞特异结合的多肽作为核素载体,制成探针,可以对肿瘤进行早期诊断和转移灶的定位,还可以进行核素治疗；以多肽为基础的靶向药物,可以弥补化学药物在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤正常组织和器官的弊端,使得肿瘤治疗进入一个新时代.
-
噬菌体展示体内筛选技术及其应用进展
噬菌体展示技术是将高度多样性的多肽或蛋白展示于噬菌体衣壳蛋白表面的一项技术.这一技术将展示分子的基因型和表型联系在一起,极大地方便了多肽或蛋白分子的功能性筛选.从噬菌体展示文库中筛选出的多肽或蛋白具有高度的特异性和极强的亲和力,在生物医学基础研究和临床诊断治疗中具有重要的应用价值.随着噬菌体展示技术的不断发展,已将其用于活体的体内筛选.体内筛选技术发挥了高通量筛选的特点,能够在活体水平研究血管表面的分子表达状况,分析不同器官血管表面分子的表达差异,从而为临床靶向性诊断和治疗提供实验依据.
