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三种丙型肝炎病毒核蛋白在人肝癌细胞的表达
目的用基因芯片分析丙型肝炎病毒(HCV)三种基因型HCV-1b、HCV-2a和HCV-4d核蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)的基因表达,重新认识HCV 核蛋白功能及其致病机制.方法建立表达HCV三种基因型核蛋白的Huh-7细胞系,提取总RNA制备探针,与Affymetrix人基因芯片HG-U133 杂交.对基因表达改变≥3或1.5倍的基因,通过Affymetrix网站用NetAffx进一步分析,并按生物学功能分类.结果 HCV-1b 核蛋白引起16个基因表达改变,其中免疫反应基因PF4V1和 SPP1分别上调3.4和4.4倍;HCV-2a 核蛋白对免疫反应基因CXCL5和凋亡基因BTF分别下调3.4和3.1倍,但对凋亡基因HRK、LZTS1则能上调3.2和3.4倍;与HCV-1b 和HCV-2a 核蛋白相比,HCV-4d 核蛋白可引起111个基因表达改变,对基因表达谱有更明显的影响.若设定基因表达改变≥1.5倍有意义,HCV-1b 和HCV-2a核蛋白可引起若干相同基因的改变.结论 HCV三种基因型核蛋白引起的基因表达谱各有特点,主要涉及免疫反应、凋亡、信号传导等基因,这对重新认识HCV 核蛋白功能及致病机制均有重要意义.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的影响
目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对端粒酶活性的影响,以探讨HCV NS3蛋白在HCV致癌中的作用,并观察端粒酶活性原位检测法的应用价值.方法利用HCV NS3真核细胞表达质粒pRcHCNS3-5′(表达HCV NS3 N端多肽),pRcHCNS3-3′(表达HCV NS3C端多肽)和空白质粒pRcCMV转染NIH3T3细胞,分别获得11、11和8个阳性克隆;采用链霉素抗生物素-过氧化物酶法(SP)免疫组织化学方法检测转染的NIH3T3细胞中HCV NS3蛋白表达,并通过端粒酶活性原位检测法和端粒酶聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附反应(ELISA)技术分别检测转染前后NIH3T3细胞端粒酶活性的定位和定量变化.结果 HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-5′或pRcHCNS3-3′转染的NIH3T3细胞均表达HCV NS3蛋白,HCV NS3蛋白阳性信号均位于细胞质中,并以前者表达的阳性信号为强(χ2=6.667,P<0.05),各组细胞端粒酶活性存在显著差异(F=143.083,P<0.01),其中质粒pRcHCNS3-5′转染的NIH3T3细胞端粒酶活性强,11个克隆均呈阳性,质粒pRcHCNS3-3′转染的细胞次之(P<0.05),空白质粒pRcCMV转染细胞和未转染NIH3T3细胞弱;HCV NS3蛋白的表达水平和端粒酶活性强度之间具有显著相关性(rs=0.808 4,P<0.01);采用端粒酶活性原位检测方法和端粒酶PCR ELISA技术检测结果具有较好的一致性(rs=0.501 96,P<0.01).结论 (1) HCV NS3蛋白可能是通过内源性机制激活细胞端粒酶导致宿主细胞恶性转化;(2) HCV NS3蛋白 N端多肽对宿主细胞端粒酶的激活作用强于C端多肽;(3) 进一步证实端粒酶活性原位检测法是一种适合于病理形态与功能研究的技术.
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丙型肝炎病毒1b型5′非编码区基因变异及遗传进化分析
目的研究我所发现的丙型肝炎病毒(HCV)1b基因型5′非编码区 (5′NCR) -222位C-T变异的病毒株,是否为1型中的其他亚型.方法对64例HCV 1b型的样本进行5′NCR扩增后作BamH I酶切,并从有此BamHⅠ位点的样品中随机选取了6例样品扩增5′NCR和NS5B区,测序后对5′NCR进行序列分析,NS5B区序列分别与GenBank中1型的各亚型序列以及38株来自世界不同地区的1b型参考序列构建遗传进化树.结果 6例样本与GenBank中1型的各亚型NS5B区遗传进化树分析结果显示这6株都属于1b型,而非1型的其他亚型,6株变异株与38株来自世界不同地区的1b型参考序列NS5B区的进化树分析结果显示,6例样品并未形成1b型中的独立分支,在遗传进化上与其他38株HCV 1b型病毒株没有明显差异.结论本文的研究证实了我们所发现的HCV 1b型5′非编码区有BamHⅠ位点的病毒株确为1b型的变异株,并非1型的其他亚型.而这种变异与干扰素耐药是否具有相关性,尚有待于进一步研究.
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用酶联免疫夹心法测定肝炎患者血清丙型肝炎抗原
目的建立血清中丙肝病毒NS3抗原(HCAg-NS3)的酶免检测方法.方法以特异性强、敏感度高、识别不同HCAg-NS3抗原表位的HCAg-NS3单克隆抗体和高效价的纯化抗-HCV分别作为包被抗体和酶标记抗体,采用夹心ELISA法测定血清中HCAg-NS3抗原.结果优化了酶免疫反应条件;该方法对HCAg-NS3的低检测限为1～2 ng/ml;批内(n=13)及批间(n=3)变异系数(CV)分别为4.51%和5.64%;对52例抗-HCV阳性血清测定HCAg-NS3抗原的检出率为21.2%, 对15例HCAg-NS3阳性标本测定HCV RNA的检出率为60%,1350例抗-HCV阴性的其他类型肝炎患者血清标本中,HCAg-NS3检出率为1.7%,50例正常人血清标本的HCAg-NS3抗原测定结果均为阴性.结论该方法敏感性较高,特异性、重复性和稳定性均良好,可以作为早期诊断HCV感染的有效方法.
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寡核苷酸阵列芯片检测丙型肝炎病毒的基因型及临床应用
目的建立寡核苷酸阵列芯片方法,检测丙型肝炎病毒(HCV)感染后丙型肝炎患者的基因型.方法采用合成后点样的方法把自行设计合成的一系列寡核苷酸探针固定在经过修饰的显微镜载玻片上,制成用于HCV检测的基因芯片.结果对62例血清HCV RNA阳性HC患者进行基因分型,武汉地区HCV的流行株基因型主要为1b亚型(44.64%),2a亚型(19.65%)及混合型(7.14%),其余基因亚型较少见.结论采用寡核苷酸阵列芯片技术可对HCV进行基因型以及基因亚型的分析,方法快速、简便、敏感、特异.
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中国HCV5'-非编码区复合酶切分型及其3b基因型序列分析
目的研究中国丙型肝炎病毒(HCV)不同基因型感染分布情况,并对3b序列进行分析. 方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT -PCR)技术扩增HCV5'NCR 1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a不同基因型的cDNA及187份HCV RNA阳性样品中cDNA.A应用BHH (BsrB I、HaeⅡ、Hinf I)复合内切酶消化5′-NCR cDNA,B应用BstUⅠ消化,C应用HaeⅢ消化,电泳检测片段大小.结果 187例HCV RNA阳性患者A B C分型结果表明,1b型感染率占67.38%,2a型12.30%,1b/2a 型为5.88%,3b型 5.35%,2b型3.21%,2a/2b、1b/2b型各为2.14%,1a型1.07,6a型0.54%.3份3b基因型5'-NCR A-T克隆测序结果表明,3株3b型之间同源性为99.54%～100%.其中chiKQ50与GI514395 3a株为96.28%与GI676877 3b株同源性为98.6%,与1a型为93.49%,与1b型为94.88%,与2a型为91.63%,与2b型为89.30%,与4a型为95.35%,与6a型为93.4%,结论研究结果表明该项分型技术既保证了RT- PCR检测灵敏度,又具有良好的分型效果.提示:该分型方法不仅适合中国HCV基因型检测,对亚洲及欧洲和非洲HCV分型研究也具有一定的参考价值.
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丙型肝炎病毒1b亚型诊断芯片的制备与实验室研究
目的建立一种简单有效的制备、筛选丙型肝炎病毒(HCV)1b亚型cDNA基因芯片探针的技术.方法应用cDNA文库法制备芯片探针,限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV-1b全长cDNA,所得的酶切片段在72℃补平加单个碱基A,然后与pMD18-T载体连接,AT克隆,用载体引物进行PCR初步鉴定,并测序.将筛选出的片段打印在氨基修饰的玻片上制备成cDNA芯片并进行杂交验证分析.样品标记采用限制性显示PCR(Restriction Display PCR RD-PCR)技术.结果应用cDNA文库法,共得到22大小相对一致(250～750bp)的基因片段,序列分析表明,均属于HCV-1b基因,可以作为诊断芯片探针;芯片杂交结果显示,样品和诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳.结论用cDNA文库法收集片段是一种快速、简便制备芯片探针的实用方法;制备的诊断芯片可以用于检测HCV-1b RNA,具有敏感、检测结果较为可靠的优点.
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核酸扩增检测在血液筛查的初步应用
目的为提高血站供血安全性，探讨核酸扩增检测在血站血液筛查中的可行性。方法在酶联免疫吸附试验(ELISA)常规筛查血液的基础上，采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法，检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗体(抗-HCV)和人免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV)1/2呈阴性的献血者微量血浆汇集池标本（20人份×50 μl汇集）中的丙肝病毒（HCV）和乙肝病毒（HBV）核酸，再对阳性汇集池中的标本进行单份检测。结果 8 805份（分442个汇集池）血液被检测HCV RNA，结果有1例（0.01%）为阳性；1 441份血液被检测HBV DNA，结果6例（0.4%）为阳性。从标本汇集到筛查出单份阳性献血者大约需要3 d。结论 ELISA结合荧光定量PCR检测微量血浆汇集池标本的方法筛查血液HBV和HCV感染是可行的，能够进一步提高输血的安全性。
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两种定量测定丙型肝炎病毒核酸的聚合酶链反应方法比较
目的观察荧光定量聚合酶链反应(PCR)PE5700测定丙型肝炎病毒RNA的准确性。方法所用临床评价血清盘由36份血清组成，其中包括1个5倍倍比稀释系列（7份）、9份阴性血清和20份阳性血清。使用临床评价血清盘比较2种测定方法的重复性、线性和临床样本符合情况。结果实时荧光定量方法和全自动PCR-ELISA 内标法检测系统的线性回归系数分别为0.973 2和0.999 5。全自动PCR酶联免疫吸附(ELISA)内标法检测系统不同含量的样本批内变异系数（log10）均比实时荧光定量方法低。临床样本的检测实时荧光定量方法与全自动PCR-ELISA 内标法检测系统的相关系数为0.845。结论实时荧光定量方法具有良好的线性和重复性，同时与全自动PCR-ELISA 内标法检测系统有良好的相关性。
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人类免疫缺陷病毒/丙型肝炎病毒共感染对实验室诊断影响的研究
目的研究人类免疫缺陷病毒(HIV)/丙型肝炎病毒(HCV)共感染对两种病毒感染实验室诊断的影响.方法对300例经免疫印迹试验(WB)确认的HIV感染者,以酶免疫测定HCV抗体,测定CD4/CD8计数;其中197例测定病毒载量,逆转录聚合酶链反应检测HCV核酸,阳性样品限制性片段长度分析丙肝分型,比较共感染和非共感染组在各检测诊断指标的差别.结果 HCV诊断:HCV抗体阴性组中19.5%为核酸阳性.多元回归分析,HCV核酸阳性,1b+2a混合感染,1b 基因型的感染3个因素对HCV EIA检测的S/CO值的升高有独立的显著影响. HIV 诊断:300例,共感染组和非共感染组HIV ELISA A<3的样本比例分别为4/265,5/41,有P<0.01的差异有统计学意义; A>3的样品中CD4分组后按比例取77份比较WB条带,共感染组P55条带出现率显著高于非共感染组(16/30,12/47,P<0.01).结论 HIV免疫抑制可造成很高的HCV抗体假阴性率,该人群推荐HCV核酸定性检测.共感染对HIV ELISA检测的影响表现为强阳性比例的显著提高;对HIV WB各主要诊断条带未见影响,共感染组p55条带比例显著高可能提示病毒间免疫和分子水平相互作用.对HCV EIA-3的S/CO值有独立影响的因素包括HCV核酸阳性,1b+2a混合感染,1b 基因型.
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HGV/GBV- C与HCV混合感染者外周血单个核细胞及肝脏中相关病毒负链RNA的检测意义
目的自从建立起甲、乙、丙、丁、戊5种肝炎病毒的病原学诊断之后,仍有少部分肝炎患者的病因得不到明确,因此不少学者试图探索是否还有新型肝炎病毒的存在,并进行了大量的流行病学和实验诊断的研究,认为的确存在可经肠道外传播并引起人类肝炎的致病因子目前关于庚型肝炎病毒(HGV/GBVC)的致病性和组织嗜性尚无结论性资料.我们研究了HGV/GBV-C与HCV混合感染者PBMC和肝脏中HGV/GBV-C复制中间体(负链RNA)的存在状况.方法应用逆转录-巢式PCR技术,检测了32例肝炎患者PBMC和肝脏中HGV/GBV-C和HCV正、负链RNA.结果 26例HGV/GBV-C与HCV混合感染者PBMC和肝脏中均未检测到HGV/GBV-C负链RNA;而在9份PBMC和15份肝脏标本中检出HCV负链RNA.结论 HGV/GBV-C与HCV混合感染时,在PBMCC和肝脏中尚未发现该病毒复制的证据,提示在肝炎病毒混合感染患者中,PBMC和肝脏可能不是HGV/GBV-C的复制场所
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聚乙二醇与二甲基亚砜促进HCV体外感染树鼩肝细胞的作用
目的观察聚乙二醇(PEG)与二甲基亚砜(DMSO)在HCV体外感染树鼩肝细胞中的作用.方法我们采用两步灌流法分离树鼩肝细胞,并用L15培养基予以培养,培养3 d接种HCV-RNA阳性血清,在接种感染血清前90min加40 g·L-1PEG与15 g·L-1,然后再接种HCV-RNA阳性血清温育6 h～8 h,并收集不同时相的细胞和上清以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测其中HCV正负链RNA.结果未加PEG与DMSO时,细胞内正负链RNA首次检出是感染后d 5,至d10仍可间断检出,培养上清正链首次检出是感染后d 3,d10亦呈阳性;加PEG与DMSO时,细胞内负链首次检出是感染后d 3,至d17仍可间断检出,细胞内正链首次检出是感染后d 3,至d15仍可间断检出,培养上清正链RNA首次检出感染后d 3,至d15亦呈阳性结论加PEG与DMSO细胞内正负链RNA首次检出时间较早,检出率较高,持续时间较长.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响
目的 考察丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响,以期从另一个角度研究丙型肝炎病毒可能的致癌机理.方法应用流式细胞仪检测HepG2-C细胞和HepG2-CMV细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)和去血清的耐受.并进一步检测凋亡相关基因及产物的表达.结果应用流式细胞仪检测HepG2-C细胞和HepG2-CMV细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)的耐受,结果HepG2-C细胞24小时和48小时的凋亡率分别为5.1%和9.6%,而HepG2-CMV细胞为6.8%和16%.而去血清2,4,6天的HepG2-C细胞凋亡率分别为6.6%,9.4%,11.5%,而HepG2-CMV细胞分别为11.4%、13.5%、16.1%.表明表达丙肝病毒核心蛋白的细胞HepG2-C较转染空载体的细胞HepG2-CMV耐受凋亡.在进一步分子机理的探讨中发现HepG2-C细胞P53,C-myc,Bc1-2表达增加,而Fas表达减低,转录水平也发生同样的变化.结论丙肝病毒核心蛋白可能通过调节基因转录与表达,抑制某些因素引起的细胞凋亡.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A抑制肿瘤坏死因子α诱导HepG2细胞凋亡的作用研究
目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)对肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导HepG2细胞凋亡的抑制作用.方法设计HCV-1b NS5A区基因片段的特异引物,以逆转录巢式PCR方法扩增NS5A基因片段,并将其进行TA克隆,对阳性克隆进行酶切与序列鉴定;构建NS5A基因表达载体;通过Lipofectamine基因转染法,将NS5A区基因导入HepG2细胞,加入TNFα培养48h;应用Western blot检测caspase-3被切割、细胞色素C释放的情况以及通过AnnecxinV-FITC染色两种方法,观察NS5A蛋白对TNFα诱导的HepG2细胞凋亡的抑制效应. 结果成功建立HCV NS5A蛋白真核表达转基因细胞模型,发现该蛋白对TNFα所诱导HepG2细胞凋亡有抑制作用.结论 HCV NS5A蛋白可以抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡.
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抑制性RNA在细胞内对丙型肝炎病毒5′非编码区翻译启动的抑制作用
目的研究核糖体内部进入位点(IRES)特异性抑制性RNA(IRNA)在细胞内对HCV 5′非编码区(NCR)IRES翻译启动功能的抑制作用.方法通过脂质体介导的基因转染方法,转染IRNA真核表达体与带荧光素(luc)的靶基因真核表达载体于人肝癌细胞(HHCC),应用发光仪检测luc报告基因的表达活性.结果 IRNA能有效地抑制由HCV 5′NCR IRES介导的luc基因表达,抑制率高达90%,低50%,而IRNA突变体(mIRNA)无此活性.结论 IRES特异性IRNA能有效地抑制HCV 5′NCR介导的蛋白翻译启动作用.
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丙型肝炎病毒核心基因转染对胆管癌细胞中端粒酶逆转录酶mRNA表达的调控
目的探讨丙型肝炎病毒核心基因(hepatitis C virus core gene,HCV C)调控端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因表达在肝门部胆管癌发生中的作用. 方法将构建成功的HCVC基因重组真核表达载体pcDNAHCV-C和空载体与绿色荧光蛋白基因共转染胆管正常上皮细胞(BEC)和胆管癌细胞QBC939中,RT-PCR和免疫组织化学方法分析转染后细胞内hTERT mRNA和蛋白的表达. 结果 pcDNAHCV-C在BEC和 QBC939细胞中的转染率为16%和32%,转染HCV C的BEC组表达hTERT mRNA,而转染空载体的BEC不表达hTERT mRNA;表达HCVC蛋白QBC939中hTERT mRNA和蛋白的表达明显高于空载体组. 结论 HCV C转染上调hTERT基因的表达,可能是HCV C诱发胆管癌的一种途径.
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肝炎病毒感染与肝门部胆管癌发病关系的探讨
目的探讨乙型肝炎(乙肝)和丙型肝炎(丙肝)病毒感染在肝门部胆管癌发病中的作用. 方法采用免疫组织化学方法对68例石蜡包埋肝门部胆管癌患者手术标本中乙肝病毒X蛋白和丙肝病毒C蛋白水平进行检测,并结合临床资料进行分析. 结果 68例肝门部胆管癌中乙肝病毒X蛋白阳性率为8.8%(6/68),丙肝病毒C蛋白阳性率为35.3%(24/68),两者均阳性1例(1.5%);乙肝、丙肝病毒感染的肝门部胆管癌在分化程度(χ2=8.7,P<0.01)、浸润程度(χ2=67.8,P<0.01)、淋巴结转移(χ2=4.3,P<0.05)、根治程度(χ2=5.1,P<0.05)与非病毒感染的肝门部胆管癌比较差异有显著意义. 结论乙肝病毒X蛋白、丙肝病毒C蛋白可能在乙肝、丙肝病毒感染肝门部胆管癌的发病原因中起重要作用.乙肝、丙肝病毒感染的肝门部胆管癌恶性程度高,可能预后较差.
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丙型肝炎病毒感染孕妇羊水中丙型肝炎病毒RNA检测的临床意义
目的通过检测丙型肝炎病毒(HCV)感染孕妇的羊水中HCV RNA,探讨HCV母婴传播的途径及HCV基因型.方法应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和逆转录巢式PCR(RT-nPCR)技术,检测孕妇血清和羊水中的HCV RNA.对34例(研究组)血清HCV RNA阳性标本采用酶切分型法检测,依据限制性片段长度多态(RFLP)图谱判断HCV基因型.另选40例正常孕妇(对照组)的血清和羊水作为对照.结果在研究组孕妇羊水中仅有2例(5.9%)检测出HCV RNA,病毒滴度分别为105、106拷贝/ml;对照组孕妇血清和羊水标本中均未检测出HCV RNA.研究组孕妇血清中HCV RNA阳性标本HCV基因分型为:Ⅱ型27例(79.4%),Ⅲ型5例(14.7%),Ⅱ/Ⅲ混合型2例(5.9%).结论 HCV感染孕妇的羊水中HCV RNA阳性率极低,提示羊水不是HCV母婴传播的主要途径.HCV感染孕妇的HCV RNA基因型以Ⅱ型为主.
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抗HCV不同位点核酶细胞内对病毒基因的抑制作用
为探讨核酶细胞内对HCV基因表达的抑制作用，笔者设计合成了两个针对HCV 5′NCR213位点和C区498位点的锤头结构核酶，并插入真核表达载体pcDNA3。应用WISH-nc转基因细胞模型，通过脂质体法转染核酶表达载体，经发光检测仪测定荧虫素酶报告基因的表达变化以反应病毒基因的抑制率。结果显示，核酶213和核酶498均能在细胞内降低荧虫素酶的表达，转染后7日内的抑制率为42.94%～67.81%。提示增加核酶作用位点可防止病毒基因突变后的切割失效，但不能显著提高抑制率。
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HCV包膜蛋白E2的表达及其抗原性的检测
为研究丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2在原核细胞和真核细胞中的表达,并对表达蛋白的抗原性进行检测.将HCV E2区N端的一段基因分别克隆入原核表达载体pQE30和真核表达载体pEF1/HisC中进行E2蛋白的表达,采用ELISA和WB对表达蛋白的抗原性进行检测.结果在原核细胞和真核细胞中均表达了预期大小的蛋白,能同 HCV感染者血清发生特异性反应.提示该段E2基因在原核表达系统和真核表达系统均能表达出具有抗原活性的蛋白,其中真核细胞表达的蛋白可被糖基化.
