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蛋白激酶Cδ对燃煤污染型砷中毒肝损伤的调控机制
目的 探讨蛋白激酶Cδ(protein kinase C8,PKCδ) mRNA转录和蛋白表达在燃煤型砷中毒肝损伤中的作用.方法 人群研究:选取符合条件的贵州省燃煤污染型砷中毒病区133例砷暴露者纳入砷暴露组,包括病区非病例组(25例)、无明显肝病组(38例)、轻度(43例)和中重度(27例)肝病组；选取非砷污染村34名健康居民纳入对照组.采集上述研究对象的尿液和外周血,测定尿砷含量及外周血PKCδ mRNA表达水平.动物实验:采用随机数字表法将30只Wistar大鼠分为对照组、饮水型砷中毒组和燃煤污染型砷中毒组(即低、中、高砷粮食污染组),每组6只.对照组常规喂养,饮水型砷中毒组给予10 mg/kg As2O3水溶液,燃煤污染型砷中毒组喂饲用病区高砷煤烘烤的玉米粉所配制的饲料(砷含量分别为25、50和100 mg/kg),均喂养3个月.测定其尿砷含量、外周血和肝组织PKCδ mRNA表达水平及肝组织磷酸化蛋白激酶C8 (phosphorylated protein kinase C8,pPKCδ)表达水平.结果 非病例组、无明显肝病组、轻度和中重度肝病组尿砷含量中位数(四分位数)分别为25.58(18.62 ～ 40.73)、56.66(38.93 ～ 76.77)、64.90(39.55 ～98.37)和75.47(41.30～109.70) μg/g肌酐,除病区非病例组外,其余组均高于对照组[23.34(17.84～37.45) μg/g肌酐](P值均＜0.05).大鼠饮水型砷中毒组和低、中、高砷粮食污染组尿砷含量分别为2223.61(472.98～3976.73)、701.16(194.01～1300.27)、1060.94(246.33～2585.47)和3101.11 (1919.97～5407.07) μg/g肌酐,均高于对照组[94.32(22.65 ～ 195.25) μg/g肌酐](P值均＜0.05)；肝组织中pPKCδ蛋白表达水平分别为324.83±25.06、278.50±30.57、308.83±34.67、326.33±35.09,均高于对照组(240.17±28.07)(P值均＜0.05)；肝组织细胞膜中pPKCδ蛋白表达水平分别为0.49±0.06、0.33±0.05、0.37±0.06、0.50±0.08,均高于对照组(0.28±0.04)(P值均＜0.05)；细胞浆中pPKCδ蛋白表达水平分别为0.38±0.06、0.31±0.05、0.35±0.05、0.36±0.05,均高于对照组(0.24±0.05)(P值均＜0.05).结论 砷可能通过调控pPKCδ蛋白表达,诱导其膜转位活化,导致燃煤型砷中毒肝损伤的发生发展.
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甘油二酯激酶ξ、蛋白激酶Cδ和Tis21在发育中大鼠脑的表达和定位
目的 探讨甘油二酯激酶ξ(DGKξ)、蛋白激酶Cδ(PKCδ)和Tis21在大鼠胚胎脑的时空表达模式以及与脑发育的关系. 方法 胚龄(E)9.5～ E18.5大鼠胚胎各5只,连续切片用于免疫组织化学方法检测DGKξ、p-PKCδ和Tis21在大鼠胚胎脑的表达;22只胚龄E11.5、E12.5、E14.5、E16.5和E18.5大鼠胚胎用于Westernblotting,检测DGKξ、磷酸化PKCδ(p-PKCδ)、PKCδ和Tis21在大鼠胚胎脑组织的表达.结果 免疫组织化学显示,于E9.5 p-PKCδ和Tis21在神经沟神经上皮呈阳性表达,DGKξ为阴性;E10.5 ～ E11.5,DGKξ、p-PKCδ和Tis21在脑泡壁均呈阳性表达;在E12.5三者均表达于端脑、间脑、中脑腹侧和脑桥处神经上皮,而中脑背侧、峡部和小脑原基仅DGKξ呈阳性表达,p-PKCδ和Tis21呈阴性;于E13.5三者沿海马、隔、苍白球及嗅脑呈阳性分布,在新皮质呈阴性,p-PKCδ和Tis21在峡部和小脑原基出现阳性表达;于E14.5 DGKξ表达延伸到新皮质,在脑的各个区域呈现出全阳性.而p-PKCδ和Tis21表达仅延伸到中脑顶盖,在新皮质仍为阴性;于E15.5 p-PKCδ和Tis21在新皮质出现阳性表达,在脑的各个区域均呈阳性;E16.5 ～ E18.5,三者在小脑和脑桥表达范围缩小;DGKξ和p-PKCδ可表达在神经上皮细胞的胞质,或胞质和细胞核.Western blotting显示,DGKξ和Tis21在E11.5 ～ E14.5表达逐渐增多,E12.5较E11.5显著增多,在E16.5和E18.5逐渐下降;p-PKCδ/PKCδ显示PKCδ活性变化趋势与DGKξ表达趋势一致.结论 DGKξ、p-PKCδ和Tis21时空表达与脑发育模式一致,DGKξ和p-PKCδ在神经上皮细胞的亚细胞分布提示它们主要通过DGKξ/Tis21和PKCδ/Tis21途径参与脑的发育.
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高糖对血管内皮细胞蛋白激酶Cα和δ表达及功能的影响
以高糖培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)研究显示,高糖可诱导血管内皮细胞(EC)功能紊乱,凋亡增加,NO浓度降低,可溶性细胞间黏附分子1水平增加;高糖可诱导HUVECs 的蛋白激酶C(PKC)α及PKCδ表达位置转移,PKCδ表达增强,但对PKCα表达影响不明显.高糖所致EC功能异常,可能部分是通过PKCα及PKCδ途径来实现的.
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蛋白激酶Cδ在高糖致人脐静脉内皮细胞周期阻滞和凋亡中的作用及机制
目的 探讨蛋白激酶C(PKC)δ在高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)周期阻滞和凋亡中的作用及机制.方法 实验按以下分组方式处理细胞:正常葡萄糖对照组(NG,D-葡萄糖5.mmol/L),Ad5-null转染+正常葡萄糖培养组(NN,D-葡萄糖5.6mmol/L),高糖培养组(HG,D-葡萄糖25mmool/L),Ad5-PKCδ转染+高糖培养组(PHG,D-葡萄糖25mmol/L),Ad5-PKCδ转染+高糖+PKCδ抑制剂Rottlerin处理组(PHR,10μmol/L,Rottlerin).激光共聚焦显微镜下观察高糖刺激的PKCB表达变化,流式细胞技术检测各组细胞周期分布、凋亡率.免疫印迹检测磷酸化叉头蛋白O1(p-FOXO1)(S256)及P27kup1蛋白表达水平.结果 与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P>0.05).与NG组比较,HG组PKXδ在HUVECs内的表达显著增加,细胞质与细胞核荧光比值下降,细胞G0/G1期阻滞增加,凋亡率上升,p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平升高(P<0.05).与HG比较,PHG组过表达PKCδ后,细胞质与细胞核荧光比值明显下降(P<0.05),G0/G1期阻滞增加,凋亡率上升(P<0.05),p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平进一步升高(P<0.05).与PHG组比较,PHR组特异性抑制PKCδ活性后,细胞质与细胞核荧光比值增加(P<0.05),细胞周期阻滞及凋亡改善,p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平降低(P<0.05).结论 高糖负荷可使HUVECs中PKCδ表达增加并发生核转位激活,导致p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平升高,使细胞阻滞于G0/G1期并发生凋亡.
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蛋白激酶Cδ对高葡萄糖刺激的HK-2细胞p66Shc磷酸化及线粒体转位的影响
目的 观察高葡萄糖作用下蛋白激酶C(PKC)δ对人肾小管上皮细胞株(HK-2)p66Shc转录后蛋白磷酸化及线粒体转位的影响.方法 以HK-2细胞作为体外观察的细胞,采用不同浓度的D-葡萄糖进行刺激,分别用实时定量PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测PKCδ和p66Shc基因表达及蛋白磷酸化水平;然后将HK-2细胞分为3组:5 mmol/L低葡萄糖组、30 mmol/L高葡萄糖组、30 mmol/L高葡萄糖+粗糠紫苦素(Rottlerin) 1.0 μmol/L组.采用Western印迹法和细胞免疫荧光方法检测p66Shc蛋白磷酸化水平及其线粒体转位情况.结果 高葡萄糖处理HK-2细胞后,PKCδ和p66Shc mRNA及蛋白磷酸化水平明显高于对照组[其中PKCδ mRNA及其磷酸化蛋白的表达量随着D-葡萄糖浓度(15、30、45 mmol/L)的增加分别上调0.9、1.3和1.6倍及0.4、1.5和2.0倍,均P＜0.05],且呈剂量和时间依赖;高糖+Rottlerin组p66Shc蛋白磷酸化水平及其线粒体转位明显低于对照组,(高糖+ Rottlerin组在180 min时线粒体p66Shc磷酸化蛋白表达量下调3.1倍,P＜0.01).结论 高葡萄糖可诱导HK-2细胞PKCδ和p66Shc的转录及磷酸化,PKCδ可促进高葡萄糖诱导的p66Shc磷酸化及其线粒体转位.
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大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性变化的研究
目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性及紧密连接蛋白claudin-5、occludin和蛋白激酶Cδ(PKCδ)表达的变化.方法 采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,伊文思蓝法检测血脑屏障的通透性变化,免疫组化和Western blot方法检测脑缺血组织claudin-5和occludin的表达,Western blot方法检测脑缺血组织PKCδ蛋白的表达.结果 伊文思蓝法结果表明,与假手术组比较,血脑屏障通透性在缺血1h、缺血2h、再灌注0.5 h、1h、2h时显著升高(P＜0.01).免疫组化和Western blot结果显示,与假手术组比较,脑缺血组织血管内皮细胞claudin-5和occludin的表达亦在缺血1h、缺血2h、再灌注0.5 h、1h、2h时显著下降(P＜0.01)；而PKCδ蛋白在缺血1h、缺血2h、再灌注0.5 h、1h、2h时表达显著上调(P＜0.01).结论 大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性的增加可能与claudin-5、occludin表达下降和PKCδ蛋白激活有关.
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蛋白激酶Cδ在燃煤型砷中毒患者体内的表达及其在肝损伤中的作用
目的 探讨蛋白激酶Cδ在燃煤型砷中毒患者体内的表达及其在肝损伤中的作用.方法 选择砷暴露病区286名居民为研究对象,其中燃煤型砷中毒患者156名,设为病区病例组;130名未患砷中毒,设为病区非病例组.比较两组人群尿砷和外周血PKCδmRNA相对表达水平;根据156名患者肝损伤程度分为无肝损伤组、轻度肝损伤组和重度肝损伤组,比较三组患者尿砷和外周血PKCδmRNA相对表达水平.结果 病区病例组平均尿砷、PKCδmRNA相对表达水平均明显高于病区非病例组(t=5.355-46.897,P＜0.05);病区病例组患者中,尿砷含量和PKCδmRNA相对表达水平,重度肝损伤组＞轻度肝损伤组＞无肝损伤组,比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 蛋白激酶Cδ在燃煤型砷中毒患者体内呈高表达,且表达程度越高,肝损伤越重.
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蛋白激酶Cδ在燃煤型砷中毒患者体内的表达及其在肝损伤中的作用
目的 探讨蛋白激酶Cδ(PKCδ)在燃煤型砷中毒患者体内的表达及在肝损伤中的作用.方法 于贵州省燃煤型砷中毒病区选择156例砷暴露者为砷暴露组,其中包括病区健康组(32例)、无明显肝病组(41例),轻度肝病组(39例),中重度肝病组(44例),选取非病区健康居民36例为非病区健康组.采集所有研究对象的尿液、外周血,测定尿砷含量及外周血PKCδ mRNA表达水平,化学法检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活力和丙二醛(MDA)含量.结果 非病区健康组、病区健康组、无明显肝病组、轻度肝病组、中重度肝病组尿砷含量为(18.92±3.51)、(20.12士3.84)、(46.39±5.47)、(67.98±7.64)、(75.19±8.92)μg/g,PKCδ mRNA表达水平mRNA表达量(1.11±0.06)、(1.21±0.08)、(1.23±0.12)、(1.32±0.17)、(1.39±0.21),与非病区健康组、病区健康组、无明显肝病组相比,轻度肝病组与中重度肝病组的尿砷含量明显升高,PKCδ mRNA表达水平增高,SOD、GSH-Px和TrxR活力均降低,MDA含量明显升高(P＜0.05),尿砷含量与酶活力呈负相关,PKCδ mRNA表达与酶活力呈负相关.结论 燃煤砷可能通过调控PKCδ蛋白表达,调节机体氧化应激水平,导致燃煤砷中毒肝损伤的发生发展.
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化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠PKCδ、PKCθ和PKCε表达的影响
目的 探讨化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠蛋白激酶(PK)Cδ、PKCθ和PKCε表达的影响及其神经保护机制.方法 以改进后的Zea-Longa线栓法制造局部梗死性脑缺血再灌注模型.随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组,中药高剂量组、中剂量组、低剂量组,以Longa评分法进行神经功能评分,免疫组化法观察PKCδ、PKCθ和PKCε的分布及表达.Western印迹法评测其在各组大鼠缺血侧脑组织中的表达量.结果 免疫组化结果显示:与假手术组相比,模型组PKCδ、PKCθ表达升高,PKCε表达降低(P<0.05),与模型组相比,各用药组PKCδ、PKCθ均降低,PKCε表达升高(P<0.05),其中以中药高剂量组及尼莫地平组较为明显(P<0.05).Western印迹法显示:与假手术组相比,模型组PKCδ、PKCθ表达升高,PKCε表达降低(P<0.05),与模型组相比,各用药组PKCδ、PKCθ均降低,PKCε表达升高(P<0.05),其中以中药高剂量组及尼莫地平组较为明显(P<0.05).结论 化浊解毒活血通络方可能通过降低PKCδ、PKCθ的表达、上调PKCε的表达,降低CIRI的程度.
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粗糠柴毒素对SD大鼠抗心肌缺血-再灌注损伤的作用
目的：研究粗糠柴毒素对抗心肌缺血-再灌注损伤的作用。方法结扎雄性SD大鼠心脏冠状动脉左前降支40 min造成心肌缺血，剪断结扎线进行120 min再灌注，以此构建心肌缺血-再灌注模型。实验组大鼠缺血处理前给予1μmol/L粗糠柴毒素处理，对照组予生理盐水处理。抽取血液检测血清乳酸脱氢酶（ LDH）及肌酸激酶（ CK-MB）活性。随后取出心脏并取样，将细胞裂解并离心，对提取物进行 Western 印迹测定，其中乙醛脱氢酶（ALDH）2磷酸化比例。结果实验组 LDH 活性（4079.6±88.3）U/L，对照组（5703.7±451.9）U/L。实验组 CK-MB 活性（3228.5±257.4）U/L，对照组（4433.4±319.9）U/L。实验组磷酸化ALDH2占总 ALDH2比例（0.340±0.032），对照组（0.101±0.037）。两组各指标均存在显著差异（均P＜0.05）。结论粗糠柴毒素可显著提升缺血-再灌注心肌的 ALDH2磷酸化水平并降低血清 LDH和 CK-MB 水平，诱导心脏保护。 AL-DH2激活可能参与了粗糠柴毒素的心脏保护作用。
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蛋白激酶Cδ 参与帕金森大鼠模型 中6-OHDA的神经毒性作用
目的 研究蛋白激酶Cδ(PKCδ)细胞核转移在帕金森大鼠模型神经元丢失中的病理作用.方法40只雄性SD大鼠随机分为Sham组(10只)和PD组(30只),立体定位右侧纹状体注射生理盐水或6-OHDA溶液并通过阿朴吗啡(APO)诱导旋转进行模型筛选,免疫组化检测黑质致密部(SNpc)酪氨酸羟化酶(TH)表达情况.采用Western blotting检测PKCδ蛋白表达并通过共聚焦观察PKCδ在细胞核的表达.结果PD组SNpc部位TH阳性神经元形态发生了病理改变且密度显著下降(P<0.05);Western blotting显示PD组SNpc组织中PKCδ 及Cleaved PKCδ的表达较Sham组显著上调(P<0.05);共聚焦显微镜提示PD组SNpc部位PKCδ与细胞核有共定位.结论PKCδ的酶解激活及细胞核转位可能参与了PD的神经病理发生.
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PKCδ抑制剂减轻6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞凋亡
目的 观察蛋白激酶Cδ抑制剂在6-OHDA诱导多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞凋亡过程中所起的作用,探讨帕金森病可能的分子发病机制.方法 体外培养SH-SY5Y细胞,观察PKC抑制剂对6-OHDA毒性作用的影响,分别用台盼蓝染色、流式细胞仪和透射电镜法观察细胞凋亡.结果 PKCδ抑制剂Rottlerin可减轻6-OHDA引起的细胞凋亡.而总PKC抑制剂Bisindolylmaleimide Ⅰ(Bis)和钙依赖性PKC(α和β)抑制剂G(o)6976不能减轻6-OHDA引起的细胞凋亡.结论 PKCδ抑制剂对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡产生保护作用,PKCδ可能直接参与了帕金森病人的神经元凋亡过程.
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益气健脾抗癌法对结肠癌组织PKC及亚型PKCδ、PKCε蛋白表达的影响
目的:探索益气健脾抗癌法对大肠癌组织蛋白激酶C(protein kinase C;PKC)及亚型PKCδ、PKCε表达的影响及其作用机制.方法:建立人大肠癌细胞HT-29裸鼠皮下移植瘤模型后,随机分为模型组、益气健脾组和益气健脾抗癌组.益气健脾中药由太子参、茯苓、白术、甘草、半夏、陈皮等组成,益气健脾抗癌中药由益气健脾中药加山慈菇、土茯苓、浙贝母和白花蛇舌草等组成.给药14 d后,应用Real-time PCR和Western blotting法检测肿瘤组织PKC及其亚型PKCδ、PKCε的mRNA及蛋白的表达.结果:益气健脾抗癌法治疗后,移植瘤组织中:(1) PKC mRNA和PKC蛋白表达低于模型组和益气健脾组[(0.412±0.040) vs(0.596±0.021)、(0.540±0.015)和(0.261 ±0.019) vs (0.665 ±0.016)、(0.498±0.018),P＜0.05或P＜0.01];(2) PKCδ mRNA和PKCδ蛋白表达高于模型组和益气健脾组[(0.410±0,030) vs (0.233±0.025)、(0.261±0.034)和(0.516±0.029) vs (0.301 ±0.041)、(0.361 ±0.044),均P＜0.01];(3) PKCε mRNA和PKCε蛋白表达低于模型组和益气健脾组[(0.215±0.021) vs (0.362±0.021)、(0.314±0.031)和(0.224 ±0.029) vs (0.368±0.044)、(0.359±0.029),均P＜0.01).结论:益气健脾抗癌法对大肠癌组织PKC、PKCε的抑制及PKCδ的促进作用,可能是益气健脾抗癌法治疗大肠癌的作用机制之一.
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蛋白激酶Cδ可能参与肥大心肌细胞转向凋亡
为了探讨肥大心肌细胞对凋亡刺激的易感性及蛋白激酶Cδ(protein kinase Cδ,PKCδ)在其中的作用,以内皮素-1(endothelin-1,ET-1)处理原代培养的新生大鼠心肌细胞,诱导心肌细胞肥大;再用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)作为细胞凋亡诱导因子,采用鬼笔环肽(phalloidin)荧光染色与细胞面积测量两种方法检测心肌肥大,Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡.结果显示:(1)1与10 nmol/L ET-1作用48 h,心肌细胞肌原纤维排列整齐、染色增浓,随ET-1浓度增加而愈加明显,心肌细胞表面积分别增加42.5%和67.3%,以此作为轻度和中度心肌细胞肥大模型.(2)正常、轻度肥大与中度肥大心肌细胞受1 nmol/L Ang Ⅱ处理24 h后,凋亡率分别为(15.54±1.32)%、(20.65±1.40)%与(29.33±3.52)%,三组之问有显著差异(P＜0.05).(3)受Ang Ⅱ刺激后,PKCδ特异性抑制剂rottlerin不影响正常心肌细胞的凋亡率,却有效抑制了轻度和中度肥大心肌细胞的凋亡.肥大心肌细胞凋亡易感性明显高于正常心肌细胞,抑制PKCδ可以抑制肥大心肌细胞凋亡,提示PKCδ参与肥大心肌细胞凋亡过程.
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脂肪分化相关蛋白通过抑制中性胆固醇酯水解酶表达促进RAW264.7细胞内脂质积蓄
目的 探讨RAW264.7巨噬细胞中脂肪分化相关蛋白(adipophilin)调控中性胆固醇酯水解酶(nCEH)表达进而介导脂质积蓄的作用机制.方法 用已成功构建的沉默与高表达Adipophilin的逆转录病毒质粒载体转染包装细胞PA317,继而收集病毒液感染RAW264.7巨噬细胞,筛选出Adipophilin沉默细胞株和高表达细胞株.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹分析技术(Western blot)分别检测nCEH的mRNA和蛋白表达水平,液体闪烁计数仪、高效液相色谱法检测细胞内胆固醇流出及胆固醇酯含量.结果 ①高表达Adipophilin的细胞组胆固醇、胆固醇酯含量明显高于空白对照组(P＜0.01),而沉默Adipophilin表达的细胞组则显著低于空白对照组(P＜0.01),Adipophilin可抑制nCEH mRNA和蛋白的表达.②用100 nmol/L蛋白激酶Cδ(PKCδ)激动剂佛波酯(PMA)孵育高表达Adipophilin的RAW264.7细胞30 min后,nCEH的mRNA与蛋白表达水平明显降低(P＜0.05),而用100 nmol/L PKCδ抑制剂卡马拉素(Rottlerin)同样孵育30 min后,nCEH的表达水平较对照组增高(P＜0.05).结论 Adipophilin促进巨噬细胞内脂质积蓄可能通过抑制nCEH表达来实现,在这一调控机制中PKCδ发挥了重要作用.
