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p66Shc对亚砷酸钠诱导心肌细胞氧化应激的影响
目的 探讨p66Shc在亚砷酸钠介导的心肌细胞氧化应激中的作用. 方法 利用亚砷酸钠诱导的H9C2心肌细胞氧化应激模型,分别用CCK-8比色法检测细胞活力;双氯荧光素探针检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测p66Shc、磷酸化p66Shc的表达变化;免疫荧光共聚焦检测p66Shc的亚细胞定位. 结果 与对照组相比,5 μM亚砷酸钠处理组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞内ROS水平显著升高(P<0.001);砷引起了p66Shc表达量增加,而且磷酸化p66Shc与p66Shc蛋白总量的比值也显著升高(P<0.05),p66Shc在砷刺激下从细胞浆向线粒体转位.过表达野生型p66Shc质粒增加砷介导的心肌细胞内ROS水平,而过表达突变型p66Shc质粒和敲低p66Shc的表达都降低砷处理组细胞内ROS水平. 结论 研究显示亚砷酸钠可能通过上调p66Shc的表达和磷酸化水平诱导心肌细胞ROS水平的升高.
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亚砷酸钠对胚胎p66Shc表达调控的机制研究
目的 探究亚砷酸钠对胚胎p66Shc表达调控的分子机制. 方法 利用5μmol/L亚砷酸钠处理HEK293ET细胞,收集细胞样品,利用实时定量PCR(Q-PCR)检测p66Shc转录水平,Western Blot检测Sirt1的蛋白表达;利用Sirt1 siRNA和对照siRNA分别转染细胞,随后5μmol/L亚砷酸钠处理细胞,收集细胞样品,Western Blot检测亚砷酸钠对Sirt1和p66Shc蛋白表达的影响. 结果 与对照组相比,5μmol/L亚砷酸钠处理组p66Shc转录水平显著升高(P＜0.001),Sirt1蛋白水平显著降低(P＜0.001).Sirt1 siRNA转染能够抑制细胞Sirt1的表达.亚砷酸钠处理后,Sirt1 siRNA转染组Sirt1的表达与对照siRNA转染组相比显著降低(P＜0.001),p66Shc的表达显著升高(P＜0.001). 结论 亚砷酸钠可能通过抑制Sirt1的表达上调p66Shc的表达.
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人胚肺成纤维细胞衰老过程中P66Shc 启动子区CpG岛甲基化状态
目的 探讨人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中P66Shc的表达改变及其启动子 区域的甲基化水平变化.方法 荧光定量PCR方法检测细胞衰老过程中的mRNA表达改变,甲基化特异性PCR(MSP)定性检测甲基化的变化情况,亚硫酸氢盐修饰基因组结合克隆测序定量检测启动子区域CpG岛甲基化水平.结果 人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中,P66Shc的mRNA表达水平逐渐升高,中年细胞组及复制性衰老细胞组mRNA表达分别升高至1.78和1.73倍,而早衰组却显著增高,至7.16倍；年轻细胞组、复制性衰老细胞组及早衰组P66Shc启动子区域CpG岛呈高甲基化水平,分别为94％、90％和90％.结论 人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中P66Shc的mRNA表达水平逐渐升高,其启动子区CpG岛呈高的甲基化水平,不参与该基因表达调控.
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细胞复制衰老与H2O2诱导细胞早衰过程中P66SHC基因表达谱及组蛋白修饰研究
目的 研究细胞复制衰老与H2O2诱导细胞早衰过程中P66SHC基因表达变化及复制衰老过程中组蛋白修饰改变.方法 人胚肺成纤维细胞固定传代直至停止增殖以制备复制衰老模型,过氧化氢诱导细胞早衰模型.采用Q-PCR方法动态观察细胞复制衰老与早衰过程中P66SHC以及组蛋白乙酰化酶EP300和去乙酰化酶HDAC1的基因表达,采用染色质免疫沉淀技术观察年轻细胞与衰老细胞P66SHC基因启动子区的组蛋白修饰情况.结果 P66SHC mRNA表达与染毒剂量正相关(R=0.909,P=0.000),EP300表达与染毒剂量负相关(R=-0.922,P=0.000),HDAC1与染毒剂量不相关(R=-0.066,P=0.839).P66SHC表达与群体倍增代数正相关(R =0.743,P=0.006),EP300表达和HDAC1表达与群体倍增代数负相关(R=-0.709,P=0.010;R=-0.599,P=0.040).与复制衰老组相比,早衰组细胞P66SHC、EP300及HDAC1的基因表达量均有显著性差异(t=-19.733,P=0.000;t=11.103,P=0.000;t=9.728,P=0.001).老年细胞的P66SHC基因调控区的H3组蛋白修饰丰度均降低；在转录起始点上游3.0kb处抑制基因转录的H3K9-tri-Me修饰几乎为零,选择启动子(转录起始点下游3.8kb)处的组蛋白修饰以活化转录的修饰为主.结论 P66SHC、EP300和HDAC1均可能参与细胞衰老和氧化应激诱导的细胞早衰,早衰组细胞P66SHC基因表达与复制衰老组不同；组蛋白修饰参与P66SHC的基因表达调控.
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特女贞苷对血管内皮细胞氧化损伤的作用研究
目的 研究特女贞苷对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)中p66Shc及凋亡相关蛋白表达水平的作用.方法 采用H2 O2诱导EA.hy926形成氧化应激损伤的血管内皮细胞模型,随机分为空白组、模型组(H2O2)、特女贞苷组(H2O2 +5、50、500 μmol/L特女贞苷)、阴性对照组(H2O2 +5、50、500 μmol/L DMSO)、抗坏血酸组(H2O2 +5、50、500 μmol/L抗坏血酸).检测各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、β3-gal活性;采用Western blot法测定p66Shc、caspaseG活体剪切体、Bax、Bcl-2蛋白含量;实时荧光定量PCR(qPCR)法检测p66 mRNA含量.结果 与空白组比较,模型组及阴性对照组SOD活性、Bcl-2表达量及Bcl-2/Bax比值下降,MDA含量、β3-gal活性、p66Shc蛋白水平及m RNA含量、capase-3活性剪切体和Bax表达水平升高(均P＜0.05).与模型组比较,特女贞苷组及抗坏血酸组SOD升高,MDA含量(除特女贞苷组浓度500 μm ol/L外)和β-gal活性降低(P＜0.01),抑制p66Shc表达及mRNA水平(P＜0.01);特女贞苷组Bax和capase-3活性剪切体(除浓度500 μmol/L外)表达水平降低,Bcl-2表达和Bcl-2/Bax比值升高(均P＜0.01).与同浓度的抗坏血酸组比较,特女贞苷组对B ax、Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比率、p66 mRNA的调节作用较明显(P＜0.05).结论 特女贞苷可能通过抑制p66Shc削弱血管内皮细胞的氧化损伤及降低凋亡相关蛋白的表达.
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绿茶多酚对人皮肤成纤维细胞UVA氧化损伤的保护作用及机制研究
目的 观察茶多酚(EGCG)对长波紫外线(UVA)引起的人皮肤成纤维细胞氧化损伤的保护作用,并探讨其相关机制.方法 以强度为10 J/cm2的UVA照射原代培养的人皮肤成纤维细胞,并在照光前后加入浓度为50 mg/L的EGCG干预处理,照光后24 h收集细胞,以比色法检测细胞上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)含量变化;实时定量PCR(Real-time PCR)法检测p66Shc mRNA表达水平变化.结果 UVA照射后可引起细胞中SOD和GSH-Px水平下降,MDA活性增加,并增强细胞p66Shc mRNA表达;加入EGCG干预可明显恢复SOD和GSH-Px活性,降低MDA水平,并抑制p66Shc表达(P＜0.05).结论 EGCG可有效保护人皮肤细胞免于UVA氧化损伤,其机制可能与调控p66Shc基因表达有关.
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衰老蛋白p66Shc在糖尿病发生中的作用
p66Shc是一种重要的衰老蛋白,可通过诱导多种类型细胞的凋亡和坏死促使机体老化,它的缺失则增强细胞对活性氧类物质的抗性并延长寿命.新研究发现p66Shc还与糖尿病并发症的发生存在密切联系,如心脏损伤、内皮细胞功能紊乱等,因此其可望成为糖尿病治疗的新靶点.
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蛋白激酶Cδ对高葡萄糖刺激的HK-2细胞p66Shc磷酸化及线粒体转位的影响
目的 观察高葡萄糖作用下蛋白激酶C(PKC)δ对人肾小管上皮细胞株(HK-2)p66Shc转录后蛋白磷酸化及线粒体转位的影响.方法 以HK-2细胞作为体外观察的细胞,采用不同浓度的D-葡萄糖进行刺激,分别用实时定量PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测PKCδ和p66Shc基因表达及蛋白磷酸化水平;然后将HK-2细胞分为3组:5 mmol/L低葡萄糖组、30 mmol/L高葡萄糖组、30 mmol/L高葡萄糖+粗糠紫苦素(Rottlerin) 1.0 μmol/L组.采用Western印迹法和细胞免疫荧光方法检测p66Shc蛋白磷酸化水平及其线粒体转位情况.结果 高葡萄糖处理HK-2细胞后,PKCδ和p66Shc mRNA及蛋白磷酸化水平明显高于对照组[其中PKCδ mRNA及其磷酸化蛋白的表达量随着D-葡萄糖浓度(15、30、45 mmol/L)的增加分别上调0.9、1.3和1.6倍及0.4、1.5和2.0倍,均P＜0.05],且呈剂量和时间依赖;高糖+Rottlerin组p66Shc蛋白磷酸化水平及其线粒体转位明显低于对照组,(高糖+ Rottlerin组在180 min时线粒体p66Shc磷酸化蛋白表达量下调3.1倍,P＜0.01).结论 高葡萄糖可诱导HK-2细胞PKCδ和p66Shc的转录及磷酸化,PKCδ可促进高葡萄糖诱导的p66Shc磷酸化及其线粒体转位.
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人胚肺成纤维细胞衰老过程中P66Shc启动子区组蛋白修饰变化
目的 检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中及过氧化氢诱导细胞早衰阶段P66Shc启动子区的组蛋白修饰变化.方法 按传代情况将人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞(22 population doubling levels,22PDL)组、中年细胞(35PDL)组、复制性衰老细胞(49PDL)组和氧化应激诱导的早衰细胞(pretnature senescence,PS)组.检测P66Shc的mRNA表达及其启动子区IP1、IP2组蛋白修饰,包括组蛋白H3、H4乙酰化和H3(Lys4)甲基化修饰.结果 与年轻细胞组比较,中年细胞组、复制性衰老细胞组和早衰组人胚肺成纤维细胞P66Shc mRNA表达水平均升高,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).在P66Shc IPI启动子区(-1641-1392 bp),中年细胞组和复制性衰老细胞组以H4乙酰化修饰为主,而早衰细胞组受H3、H4乙酰化和H3(Lys4)甲基化的联合修饰；在P66Shc IP2启动子区(-129～45 bp),中年细胞组和复制性衰老细胞组受H3(Lys4)甲基化修饰,而早衰细胞组受H4乙酰化和H4(Lys4)甲基化联合修饰.结论 在细胞衰老过程中,P66Shc启动子区的组蛋白修饰参与其mRNA表达调控,复制性衰老与早衰的调控机制存在差异.
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人p66Shc重组腺病毒抑制Hela细胞增殖的体外研究
目的 探讨人p66Shc重组腺病毒抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的作用及机制.方法 Hela细胞分为空白对照组(不感染腺病毒)、阴性对照组(感染Adeno X-LacZ)和实验组(感染AdenoX-p66Shc).通过细胞生长曲线、MTT检测分析观察细胞的生长状态；DHE染色法检测细胞内活性氧生成；流式细胞仪检测细胞周期；Western Blot法检测细胞内相关蛋白的表达.结果 p66Shc重组腺病毒能够抑制Hela细胞增殖,且随着p66Shc重组腺病毒处理时间延长和剂量增加其抑制作用增强.与空白和阴性对照组比较,p66Shc重组腺病毒感染48 h后,G2/M期细胞比例明显升高,其差异具有统计学意义(P＜0.01)；同时引起Hela细胞活性氧水平显著上升,p53、CyclinB1蛋白表达显著升高,其差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 p66Shc重组腺病毒能够显著抑制Hela细胞增殖,并诱导其发生G2/M期阻滞.
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在A549细胞中靶向p66ShcshRNA的沉默效应
目的:在人非小细胞肺癌细胞A549细胞中探讨shRNA靶向慢病毒对信号衔接蛋白p66Shc的沉默效应,以更好地研究p66Shc的功能.方法:半定量RT- PCR和Western blot检测p66Shc下调后的变化情况,BrdU标记实验检测细胞的增殖变化情况.结果:在A549细胞中,运用p66Shc-shRNA干扰可以实现p66Shc在mRNA和蛋白水平的下调作用,同时发现A549细胞的增殖显著降低.结论:经过慢病毒栽体介导的p66Shc-shRNA在人非小细胞肺癌A549中可获得高效转染效果,并能产生特异性的基因沉默效应,而且对细胞的增殖有显著的抑制作用,为进一步研究p66Shc功能提供了实验手段.
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衔接蛋白p66Shc CH2结构域分泌表达载体的构建及其表达
目的:构建可以产生分泌p66Shr CH2结构域重组蛋白的质粒,期望进一步研究p66Shc的功能.方法:利用定点诱变的方法在pDisplay中去除HA和Myc表达序列,但保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域.在小鼠Igκ信号肽后是外源CH2结构域、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因.PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验.结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外感染细胞后产生重组蛋白.结论:成功构建体外可以产生p66ShcCH2结构域的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的CH2多肽和体外鉴定与p66ShcCH2结构域结合的蛋白分子实验奠定基础.
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p66 shc基因表达与老年糖尿病患者早期肾损伤的相关性
目的：研究p66shc基因在老年糖尿病患者外周血单核细胞中的表达及其与早期肾损伤指标的关系。方法采用实时PCR技术检测74例老年糖尿病患者和48例健康老年人（对照组）外周血单核细胞中p66shc基因表达水平，结合临床资料分析p66shc与早期肾损伤指标尿微量白蛋白（mAlb）、转铁蛋白（TRF）、免疫球蛋白（IgG）、α1-微球蛋白（α1-MG）和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）之间的相关性。结果 p66shc基因在老年糖尿病患者中的表达水平显著高于对照组（ P＜0.05）；与对照组相比，老年糖尿病患者 mAlb、TRF、IgG、α1-MG、NAG 均显著升高（均 P＜0.01），并均与p66shc基因的表达水平呈正相关。结论 p66shc与老年糖尿病患者早期肾损伤密切相关，可为老年糖尿病患者肾损伤的早期诊断提供新的依据。
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慢性氟中毒对大鼠脑组织蛋白激酶Cβ/衔接蛋白通路的影响
目的 观察慢性氟中毒对大鼠脑组织中蛋白激酶Cβ (protein kinase Cβ,PKCβ)/衔接蛋白(p66shc)信号通路的影响,探讨氟中毒脑损伤机制.方法 SD大鼠30只,按体质量采用随机数字表法分为对照组(饮水氟含量＜ 0.5 mg/L)、低氟组(饮水氟含量为10.0 mg/L)、高氟组(饮水氟含量为50.0 mg/L),每组10只,雌雄各半,实验期6个月.用蛋白印迹法检测大鼠脑组织中PKCβ、脯氨酰异构酶(Pin1)、p66shc、磷酸化p66shc (phospho-p66shc)蛋白表达;用免疫组织化学方法检测大鼠脑组织中神经元核抗原(NeuN)、p66shc、phospho-p66shc蛋白表达.结果 蛋白印迹法检测结果:高氟组大鼠脑组织中PKCβ、phospho-p66shc、Pin1蛋白表达[(193.00±57.53)％、(228.21±71.14)％、(201.54±50.86)％]高于对照组[(100.00±21.24)％、(100.00±40.55)％、(100.00±13.35)％,P均＜0.05].免疫组织化学方法检测结果:高氟组及低氟组大鼠脑组织NeuN蛋白表达[(49.50±12.57)％、(65,66±14.58)％]低于对照组[(100.00±18.32)％,P均＜0.01],高氟组phospho-p66shc蛋白表达[(242.66±93.01)％]高于低氟组及对照组[(152.53±60.65)％、(100.00±25.63)％,P均＜0.01],p66shc表达组间比较差异无统计学意义(F=1.01,P＞0.05).结论 慢性氟中毒导致脑组织中PKCβ、Pin1、phospho-p66shc蛋白表达水平升高,可能与慢性氟中毒脑损伤的机制有关.
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结肠癌中雌激素受体和衔接蛋白p66Shc的表达和意义
背景:雌激素和雌激素受体(ER)在结肠癌的发生、发展中起重要作用,然而ER在其中的具体作用机制尚不完全清楚.在甾类激素敏感性肿瘤细胞中,甾类激素可显著上调衔接蛋白p66Shc表达并刺激细胞增殖.目的:探讨ER和p66Shc在结肠癌中的表达特点及其临床意义.方法:以免疫组化方法检测65例石蜡包埋结肠癌组织及其癌旁非癌组织中的ER和p66Shc蛋白表达,分析p66Shc蛋白表达与结肠癌临床病理特征的相关性.结果:ER和p66Shc蛋白表达分别定位于细胞核和细胞质,结肠癌组织中的ER和p66Shc蛋白表达阳性率显著高于癌旁非癌组织(ER:47.7％对0％,P＜0.01;p66Shc:49.2％对0％,P＜0.01),且两者呈正相关(r=0.43,P＜0.05).p66Shc蛋白表达与结肠癌患者的性别、年龄以及原发肿瘤部位、肿瘤大小、大体类型、浸润深度、淋巴结转移、AJCC分期均无相关性,而与肿瘤组织学分级相关(高分化:22.2％,中分化:47.7％,低分化:75.0％,P=0.046).结论:结肠癌可能是一种雌激素敏感性肿瘤.雌激素及其受体可能与p66Shc共同参与了结肠癌的发生、发展.
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p66Shc的生物学效应及其在肾脏疾病中的作用
p66shc蛋白是ShcA基因编码的三种亚型蛋白之一,另两种亚型p46shc,p52shc作为典型的接头蛋白在传递受体型酪氨酸蛋白激酶信号中有重要作用,但已有的大量研究证实p66shc具有与之不同的功能,它参与了氧化应激,细胞凋亡及衰老等过程的调控.随着研究的深入和研究范围的扩大发现,p66shc在肾脏疾病的发生发展中亦具有重要意义.本文对近年来p66shc及其在肾脏疾病中的研究结果作一综述.
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UVB诱导人皮肤成纤维细胞的氧化应激损伤研究
目的 观察人皮肤成纤维细胞被UVB照射后的光损伤、凋亡、周期阻滞和氧化应激损伤状态,并检测氧化应激的相关信号蛋白p66Shc的表达情况.方法 用小剂量UVB多次照射培养的人皮肤成纤维细胞,以细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)化学染色法观察细胞衰老状态,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶活性和丙二醛的含量,并以Western印迹法检测p66Shc蛋白的表达.结果 SA-β-Gal染色显示,培养的人皮肤成纤维细胞在UVB照射后呈强阳性染色;细胞凋亡率在未照射的对照组为0.96%,UVB照射组为37%;而细胞周期检测显示,经UVB照射的人皮肤成纤维细胞大部分阻滞于G0/G1期(80.07%).细胞内超氧化物歧化酶水平对照组为(52.35±4.97)ng/g蛋白,UVB照射组为(7.8l±0.68)ng/g蛋白(两组比较,P＜0.01);而丙二醛水平两组分别为(3.52±0.34)ng/g蛋白和(33.91±3.20)ng/g蛋白(两组比较,P＜0.05).人皮肤成纤维细胞经UVB照射诱导后24 h,p66Shc呈弱阳性表达,48 h后表达进一步增强.结论 培养的人皮肤成纤维细胞经UVB照射后进人氧化应激增强状态.p66Shc蛋白在此过程中表达逐渐增强.
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内皮素受体拮抗剂CPU0213和钙拮抗剂CPU86017改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心衰的作用机制
为了验证内皮素受体拮抗剂CPU0213和钙拮抗剂CPU86017改善异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导的大鼠心衰的分子生物学机制,将SD大鼠均分为5组:正常组、ISO组、药物治疗组(3组).除正常组外,其余4组均皮下给予异丙肾上腺素(ISO,1 mg/kg,10 d),其中3个治疗组于第10,11天分别皮下注射:氨基胍(30 mg/kg)、CPU0213(30 mg/kg)和CPU86017(4 mg/kg).结果发现,ISO组,内皮素受体A(ETA)、iNOS、衰老蛋白p66Shc、ε型蛋白激酶C(PKCε)、瘦素受体(OBRb)、NADPH氧化酶p67phox、瘦素(leptin)mRNA或蛋白表达均上调,药物治疗后对这些异常均有逆转.CPU0213和CPU86017均通过抑制内皮素受体和氧化应激及下调p66Shc和PKCε等相关分子表达,减轻ISO引起的心衰.
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p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表达及与氧化应激的关系
目的 检测p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表达并探讨其与氧化应激的关系.方法 SD大鼠分为心力衰竭组(HF组)和正常对照组(对照组).检测心力衰竭大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)的活力及丙二醛(MDA)的含量;超声心动图检测心室舒张末内径(LVEDD)、左心室收缩末内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF);RT-PCR检测血p66Shc mRNA的表达,并对p66Shc的表达与LVEDD、LVESD、LVEF、MDA、SOD进行相关分析.结果 心力衰竭组SOD、LVEF明显下降,MDA、p66Shc明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);心力衰竭组p66Shc mRNA的表达量与LVEDD、LVESD、MDA呈正相关(r=0.636、0.620、0.645,P<0.05),而与LVEF、SOD呈负相关(r=-0.860、-0.650,P<0.05).结论 p66Shc与心力衰竭氧化应激密切相关,p66Shc可能参与心力衰竭氧化应激的过程,可为心力衰竭新的治疗途径提供依据.
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重组人p66Shc/腺病毒表达载体的构建与表达
目的 构建人p66Shc/腺病毒表达载体,观察其在内皮细胞中的表达.方法 扩增p66Shc基因并与腺病毒骨架载体进行体外重组连接,经筛选、测序确认后转染进HEK293A细胞进行包装,10 d后收集细胞裂解液感染HEK293A细胞和脐静脉内皮细胞,48 h后分别用Western印迹和免疫荧光细胞化学法检测p66Shc蛋白表达水平.结果 经测序确认目的基因p66Shc成功克隆入腺病毒载体中,转染HEK293A细胞后可在显微镜下观察到特征性的细胞病变效应,Western印迹检测和免疫荧光细胞化学法检测均表明感染了AdenoX-p66的HEK293A细胞和内皮细胞中p66Shc蛋白表达水平显著升高.结论 人p66Shc/腺病毒表达载体构建成功并能在内皮细胞中表达.
