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过氧化氢诱导HPF细胞早衰模型与细胞复制性衰老的生物学性状比较研究
目的 研究过氧化氢诱导HPF细胞早衰与细胞复制性衰老的生物学性状异同.方法 200 μmol/L H2O2染毒HPF细胞4次制备过氧化氢诱导细胞早衰模型;常规培养细胞,固定传代,直至细胞停止增殖以制备细胞复制性衰老模型.动态观测两种模型细胞的生长形态、生长特性、细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶染色及细胞周期的变化情况.结果 细胞复制衰老模型在群体倍增次数(population doubling level,PDL)至54代时细胞停止增殖,200 μmol/L H2O2诱导细胞在PDL34进入衰老;正常细胞的细胞周期PI指数与群体倍增次数负相关;与PDL50组细胞相比,200 μmol/LH2O2染毒组细胞的群体倍增时间和β-半乳糖苷酶染色差异均无统计学意义(P＞0.05),PI指数差异有统计学意义(P＜0.05).结论 200 μmol/L H2O2可诱导细胞早衰,其生物学性状与细胞复制性衰老模型不完全一致.
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人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰研究
目的 研究关于人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰.方法 常规传代培养人胚肺二倍体成纤维细胞及应用过氧化氢染毒诱导细胞早衰发生,利用细胞衰老综合指标进行评价,包括细胞形态学改变、生长曲线、寿命周期、细胞周期分布及衰老相关β-半乳糖苷酶染色等,同时检测细胞衰老不同阶段增殖细胞核抗原PCNA的mRNA和蛋白水平表达变化.结果 人胚肺二倍体成纤维细胞于52PDL(群体倍增水平)处于细胞复制性衰老状态,400μmol/L过氧化氢可短期内诱导细胞过早衰老,衰老的细胞变大扁平,饱和度降低,细胞不可逆的阻滞于G1期,衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性率增加,PCNA表达随着衰老程度的增加而逐渐下降.结论 400μmol/L过氧化氢以一定方式作用于细胞可以诱导早衰发生,细胞复制性衰老与细胞早衰具有相同的生物学特征和增殖能力.
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细胞复制衰老与H2O2诱导细胞早衰过程中P66SHC基因表达谱及组蛋白修饰研究
目的 研究细胞复制衰老与H2O2诱导细胞早衰过程中P66SHC基因表达变化及复制衰老过程中组蛋白修饰改变.方法 人胚肺成纤维细胞固定传代直至停止增殖以制备复制衰老模型,过氧化氢诱导细胞早衰模型.采用Q-PCR方法动态观察细胞复制衰老与早衰过程中P66SHC以及组蛋白乙酰化酶EP300和去乙酰化酶HDAC1的基因表达,采用染色质免疫沉淀技术观察年轻细胞与衰老细胞P66SHC基因启动子区的组蛋白修饰情况.结果 P66SHC mRNA表达与染毒剂量正相关(R=0.909,P=0.000),EP300表达与染毒剂量负相关(R=-0.922,P=0.000),HDAC1与染毒剂量不相关(R=-0.066,P=0.839).P66SHC表达与群体倍增代数正相关(R =0.743,P=0.006),EP300表达和HDAC1表达与群体倍增代数负相关(R=-0.709,P=0.010;R=-0.599,P=0.040).与复制衰老组相比,早衰组细胞P66SHC、EP300及HDAC1的基因表达量均有显著性差异(t=-19.733,P=0.000;t=11.103,P=0.000;t=9.728,P=0.001).老年细胞的P66SHC基因调控区的H3组蛋白修饰丰度均降低；在转录起始点上游3.0kb处抑制基因转录的H3K9-tri-Me修饰几乎为零,选择启动子(转录起始点下游3.8kb)处的组蛋白修饰以活化转录的修饰为主.结论 P66SHC、EP300和HDAC1均可能参与细胞衰老和氧化应激诱导的细胞早衰,早衰组细胞P66SHC基因表达与复制衰老组不同；组蛋白修饰参与P66SHC的基因表达调控.
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天然脑活素对复制性衰老细胞端粒酶活性影响的实验研究
目的 探讨天然脑活素对复制性衰老人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)端粒酶活性的影响,以阐明其延缓衰老的作用及分子机制.方法 镜下观察细胞形态变化,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖活度,TRAP-ELISA方法检测细胞端粒酶活性的变化.结果 天然脑活素孵育的MRC-5细胞老龄化不明显,细胞增殖能力较空白老龄对照组明显增加(P＜0.05);天然脑活素处理的细胞端粒酶活性较空白老龄对照组明显上调(P＜0.05).结论 天然脑活素可能通过促进细胞增殖,激活细胞端粒酶的表达,进而有效地延缓细胞的复制性衰老.
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人参皂苷Rg1诱导人白血病K562细胞复制性衰老的机制
目的 探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化.方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老.流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测复制性衰老信号通路相关P21、P53与Rb蛋白表达;透射电镜观察人白血病K562细胞衰老超微形态学改变.结果 Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,其佳作用浓度为20 μmol/L,时间为48h;诱导后的K562细胞阻滞于G2/M期;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加(P<0.05);复制性衰老通路相关蛋白P21、P53和Rb表达上调(P<0.05);端粒长度缩短加速(P<0.05);经诱导细胞呈现胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大等衰老形态学变化.结论 Rg1可能经由p53-p21-Rb信号通路诱导K562细胞呈现复制性衰老特征.
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氧化应激状态下2BS细胞DNA损伤与修复能力的增龄性变化
衰老是发生在分子、细胞及整个机体的多因素协同引起的生命弱化过程.可靠易测的衰老生物学指标的确立,对衰老机制的研究、衰老相关疾病的诊断及亚健康状态的评估、延缓衰老药物的筛选等至关重要.自1995年Chen等[1]提出氧化DNA损伤导致复制性衰老以来,众多研究提示,DNA损伤修复能力可能具有细胞衰老标志物的潜在条件[2].
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腹膜衰老机制的研究进展
机体在随着年龄增长的过程中,其全身各个器官、组织、细胞都发生着衰老的变化.腹膜衰老是机体衰老的一部分,在衰老过程中,同样出现各种形态、结构和功能上的变化.细胞衰老分为复制性衰老与应激因素所诱发的细胞早期衰老即早衰(premature senescence).绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力,当其经过一定的倍增之后,将进入终末增殖状态,即称之为细胞衰老,这种衰老是由分裂传代而达到的,故又称之为复制性衰老(replicative senescence)[1].除此以外,多种物理、化学等应激因素亦可诱导细胞进入一种应激性早衰状态(stress-induced premature senescence,SlPS).
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人胚胎肺成纤维细胞复制性衰老模型的建立
目的：建立人胚肺成纤维（ HEL）细胞，复制性衰老模型，模拟正常细胞的衰老过程。方法利用HEL细胞的复制性衰老特性，通过细胞传代培养的办法，将获得的原代HEL细胞培养直至其衰老，冻存不同代的 HEL细胞备用。然后利用β-半乳糖苷酶染色、端粒长度的检测以及p21蛋白的表达变化检测细胞的衰老状态。结果培养HEL细胞，按1∶2分瓶传代直至其衰老，终细胞代龄为64。通过染色与分子检测证实细胞随着传代逐渐衰老。结论成功建立了HEL衰老模型，为进一步研究正常细胞复制性衰老奠定了基础。
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辛伐他汀对血管内皮祖细胞复制性衰老的抑制作用及其机制
目的:探讨辛伐他汀对血管内皮祖细胞(EPCs)复制性衰老的影响,阐明辛伐他汀抗衰老的作用机制.方法:取第2代EPCs作为正常对照组,取第8代细胞作为实验组,分为高剂量辛伐他汀组(培养基中的辛伐他汀浓度为1×10-7 mol·L-1)、低剂量辛伐他汀组(培养基中的辛伐他汀浓度为1×10-8 mol·L-1)和复制性衰老细胞组.继续培养7d,流式细胞术检测各组细胞凋亡率、细胞周期以及Bcl-2蛋白的表达水平.结果:正常对照组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率低于其他3组(P＜0.05或P＜0.01);高剂量辛伐他汀组、低剂量辛伐他汀组和复制性衰老细胞组3组间早期凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05);与复制性衰老细胞组比较,高剂量辛伐他汀组和低剂量辛伐他汀组细胞的晚期凋亡率降低(P＜0.01或P＜0.05),高剂量辛伐他汀组与低剂量辛伐他汀组之间的细胞晚期凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05).与正常对照组比较,高剂量辛伐他汀组、低剂量辛伐他汀组和复制性衰老细胞组细胞大部分停滞于G0/G1期,S期及G2/M期减少(P＜0.01);实验组3组之间各细胞周期细胞比例比较差异无统计学意义(P＞0.05).正常对照组细胞Bcl-2蛋白表达的荧光强度和阳性表达率均明显高于其他3组(P＜0.01);高剂量辛伐他汀组的荧光强度和阳性表达率高于复制性衰老组(P＜0.05或P＜0.01),低剂量辛伐他汀组的阳性表达率高于复制性衰老组(P＜0.01),但荧光强度与复制性衰老组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:辛伐他汀可能通过降低Bcl 2蛋白的表达来延缓EPCs的复制性衰老.
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天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究
目的:探讨天然脑活素对人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)增殖能力和复制性衰老的影响及其机理.方法:光镜下观察MRC-5细胞衰老表型,常规计数细胞代龄、传代速度,MTT法检测细胞增殖活度,X-Gal染色法观察细胞衰老情况,计数衰老细胞百分率.结果:天然脑活素可维持细胞的非衰老表型,增加MRC-5细胞代龄,天然脑活素孵育MRC-5细胞的细胞增殖能力较空白老龄对照组明显升高(P<0.05),细胞的增殖速度显著加快.另外,天然脑活素连续培养的细胞在老龄阶段衰老细胞数显著低于老龄对照细胞(P<0.01).结论:天然脑活素可升高MRC-5细胞增殖能力,有效延缓细胞的复制性衰老.
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SIRT1/eNOS/NO通路在人参皂苷Rb1抗内皮细胞复制性衰老中的作用
目的:观察人参皂苷Rb1延缓人脐静脉内皮细胞(HUVECs)复制性衰老的作用,并探讨SIRT1/eNOS/NO通路在其中的作用机制.方法:建立原代HUVECs复制性衰老模型,根据细胞形态的变化、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达水平评估HUVECs衰老情况;采用real-time PCR方法和Western blot法检测沉默SIRT1前后衰老细胞中eNOS和PAI-1的mRNA和蛋白表达,并检测细胞上清NO的含量.结果:累积细胞群体倍增水平(CPDL)为16的HUVECs可作为复制性衰老模型;80μmol/L人参皂苷Rb1处理后衰老细胞内SIRT1和eNOS的mRNA及蛋白表达水平增加,NO含量增加(P<0.05),而PAI-1的mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05);沉默SIRT1后,衰老细胞内eNOS的mRNA及蛋白表达减少,PAI-1的mRNA及蛋白表达增加,NO含量减少(P<0.05);与SIRT1沉默组比较,在沉默SIRT1基础上加用人参皂苷Rb1后,eNOS和PAI-1表达水平及NO的含量未见明显变化.结论:人参皂苷Rb1可通过调控SIRT1/eNOS/NO通路延缓HUVECs复制性衰老.
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叔丁基对苯二酚激活骨髓间充质干细胞蛋白酶体活性延缓复制性衰老
目的：探讨叔丁基对苯二酚（ tert－butylhydroquinone ，tBHQ）在延缓骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs）复制性衰老进程中的作用，以期为细胞移植治疗提供数量充足的种子细胞。方法：30μmol／L tBHQ持续作用于体外传代晚期BMSCs 4周，化学发光法测量蛋白酶体活性；CCK－8法检测细胞活力；BrdU掺入实验检测细胞增殖能力；流式细胞术检测细胞周期分布；衰老相关β－半乳糖苷酶（ senescence－associatedβ－galactosidase ，SA－β－Gal）染色检测衰老细胞百分比；Western blot 检测衰老相关蛋白 P53表达变化。结果：30μmol／L tBHQ持续作用于传代晚期BMSCs 4周后，蛋白酶体活性较DMSO溶剂对照组上调（21．96±1．98）％（P＜0．05）。 CCK－8法显示随tBHQ浓度增加，细胞活力逐渐升高，至40μmol／L达到平台期，且至120μmol／L未见明显细胞毒性。 BrdU掺入实验显示tBHQ组阳性细胞率与DMSO溶剂对照组比较，细胞增殖能力显著提高（ P＜0．05）；tBHQ组细胞增殖指数也显著高于DMSO组（ P＜0．05）。 tBHQ组SA－β－Gal阳性率较DMSO溶剂对照组显著降低（P＜0．01），且衰老相关蛋白P53表达量也较对照组下降（P＜0．05）。结论： tBHQ能够通过提高蛋白酶体活性延缓因蛋白酶体功能障碍引起的BMSCs复制性衰老进程。
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细胞复制衰老过程中IGF2R基因表达及H3组蛋白修饰的变化
目的 研究细胞复制性衰老过程中胰岛素样生长因子2受体基因(IGF2R)的表达与H3组蛋白修饰谱的变化.方法 培养人胚肺成纤维细胞(HPF),以细胞群倍增数(PDL)为23(PDL23)为年轻组细胞,PDL=50(PDL50)为复制衰老细胞,观察细胞复制衰老过程中生物学性状改变;采用实时定量PCR法观察细胞PDL30、PDL40、PDL50 IGF2R基因的表达,并采用染色质免疫共沉淀-实时定量PCR法(chromatinimmunoprecipitationreal time quantitative PCR methods,CHIP-PCR)检测IGF2R基因转录起始区组蛋白修饰(H3-Ac、H3K9-tri-Me、H3K9-Ac和H3K4-tri-Me)的状况.结果 与年轻细胞相比,衰老细胞体积变大,增殖能力减弱,细胞周期停滞,衰老特异性β-半乳糖苷酶着色阳性,IGF2R mRNA表达增加(P＜0.05),IGF2R mRNA表达与细胞PDL呈正相关(r=0.871).相对年轻细胞而言,老年细胞的IGF2R基因在转录起始点上游0.6kb处和转录起始点下游1.2 kb处以H3-Ac、H3K9-Ac和H3K4tri-Me组蛋白修饰为主,而在转录起始点下游1.6～4.0 kb处H3K9-Ac修饰降低,H3K9-tri-Me组蛋白修饰升高,但H3K4-tri-Me组蛋白修饰占主要地位.结论 IGF2R与细胞衰老程度相关,其基因表达受H3组蛋白修饰调控,表观遗传学参与细胞衰老进程.
关键词： 复制性衰老 胰岛素样生长因子2受体 基因表达 组蛋白修饰
