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氧化应激状态下2BS细胞DNA损伤与修复能力的增龄性变化
衰老是发生在分子、细胞及整个机体的多因素协同引起的生命弱化过程.可靠易测的衰老生物学指标的确立,对衰老机制的研究、衰老相关疾病的诊断及亚健康状态的评估、延缓衰老药物的筛选等至关重要.自1995年Chen等[1]提出氧化DNA损伤导致复制性衰老以来,众多研究提示,DNA损伤修复能力可能具有细胞衰老标志物的潜在条件[2].
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槲皮素抑制HSP70表达的体外研究
目的 探讨不同浓度槲皮素抑制正常细胞和肿瘤细胞热休克蛋白70(HSP70)的表达规律,寻找槲皮素抑制HSP70表达的佳浓度,为研究HSP70的功能提供一种可行的方法.方法 加入槲皮素至终浓度为50,100,150,200 μmol/L,继续37 ℃培养6 h后,置42 ℃水浴受热1 h,于37 ℃恢复培养2 h,收获细胞.设立37 ℃培养组(正常对照)、42 ℃培养组(阳性对照)和0.1%DMSO组(溶剂对照).分别处理肿瘤细胞株A549细胞和正常细胞株2BS细胞,用Western-blot检测细胞HSP70的表达水平.结果 在A549细胞和2BS细胞中,随着槲皮素浓度的增加,HSP70表达逐渐降低.与正常对照组相比,阳性对照组和溶剂对照组的HSP70水平表达增高,差异有统计学意义(P＜0.01).在A549细胞中,当槲皮素浓度达到50 μmol/L时,HSP70表达开始下调,但与阳性对照组相比,差异没有统计学意义(P＞0.05);当槲皮素浓度达到100 μmol/L时,与阳性对照组相比,HSP70表达显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05);当槲皮素浓度达到150,200 μmol/L时,与阳性对照组相比,A549细胞HSP70表达降低更加明显(P＜0.01);150 μmol/L组和200 μmol/L组相比,HSP70水平差异无统计学意义(P＞0.05).在2BS细胞中,当槲皮素浓度达到50 μmol/L时,HSP70表达开始下调,与阳性对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);当槲皮素浓度达到100,150,200 μmol/L时,与阳性对照组相比,HSP70水平也有显著性降低(P＜0.01);150 μmol/L组和200 μmol/L组相比,HSP70水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 槲皮素可以抑制肿瘤细胞和正常细胞HSP70的表达,150 μmol/L的槲皮素处理A549和2BS细胞,抑制HSP70表达的效果佳.
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胰岛素样生长因子结合蛋白3增强子元件(IEE)的生物学特征
背景:在细胞水平,胰岛素样生长因子结合蛋白3竞争性地与胰岛素样生长因子结合阻止了胰岛素样生长因子与其受体结合,从而抑制了胰岛素样生长因子的活性.目的:观察衰老细胞中调节性蛋白质胰岛素样生长因子结合蛋白3的生物学特征.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-09在西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室完成.材料:人胚肿二倍体成纤维细胞(2BS)购于中国生物制品研究所.方法:用Northern的方法显示胰岛素样生长因子结合蛋白3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异:聚合酶链反应扩增出人类胰岛素样生长因子结合蛋白3上游包括5'-UTR区的2kb的序列,并用酶切得到4组不同长短的胰岛素样生长因子结合蛋白3启动子片段并确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件-IEE(IGFBP-3 enhancerelement)及其与蛋白结合的碱基序列等;用DNase I Footprinting法确定了IEE中与蛋白结合的核心序列.主要观察指标:①胰岛素样生长因子结合蛋白3基因在年轻和衰老细胞中的表达差异.②通过重叠寡核苷酸确定增强子元件.③通过凝胶阻滞试验证实该复合物结合活性与衰老相关的.④通过凝胶阻滞试验确定IEE与蛋白结合的碱基序列.⑤用DNase I Footprinting法确定IEE中与蛋白结合的核心序列.⑥判断与IEE结合蛋白的相对分子质量.结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3基因的表达升高:5'-ccagcctgccaa gca gcg tgcCCCggttgc-3'是胰岛素样生长因子结合蛋白3的增强子元件;该元件与蛋白结合的核心序列是CTG CCA和GCGTGC CCC G,而且这种结合是与衰老相关的:结合蛋白的相对分子质量大约在27 000.结论:在2BS细胞中发现了一个新的转录增强子,它与蛋白结合的核心序列是CTGCCA和GCG TGC CCC G,可与一个大约27 000的蛋白结合:在衰老细胞中可选择性地促进胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达.
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间质性肺纤维化治疗药物的筛选试验及作用机制的研究
目的环磷酰胺CTS,甲氨喋呤MTS,甲基强的松龙M-pred,秋水仙碱COLC,刺五加APS,环孢霉素A CsA,观察6种作用机制不同的免疫抑制剂,对人胚肺二倍体纤维母细胞(2BS)的影响,初步筛选出治疗肺纤维化更有效的药物.方法采用生物活性法观察6种不同浓度的药物在不同时间对2BS细胞的增殖抑制作用,利用流式细胞仪检测药物诱导2BS细胞凋亡小体形成百分率及其细胞周期的影响.结果①6种药物对2BS细胞均有增殖抑制作用,与无药空白对照组比较均有显著差异(P＜0.01),CsA作用明显大于其它5种药物(P＜0.05).②6种药物均有诱导2BS细胞凋亡作用,各种药物组2BS细胞凋亡小体形成百分率与无药空白对照组比较差异显著(P＜0.01),CsA的作用强,明显高于其它药物.③6种药物对2BS细胞的作用呈现一定的时效和量效关系,即细胞增殖抑制率(CIR%)随着药物浓度的增加和时间的延长而增高,CsA作用明显.④CsA对细胞整个增殖期均有作用,M-pred和APS作用于S期,COLC作用于G2/M期,MTS,CTX作用于G0/G1期向S期过渡阶段,使G0/G1期细胞发生阻滞.结论实验中的6种药物均有抑制2BS细胞增殖和诱导其凋亡作用,其中CsA作用强,可能CsA为治疗肺纤维化疗效更好的药物.
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两种方法制备的水痘-带状疱疹病毒(Oka株)毒种感染2BS细胞的敏感性
目的 用现有方法及新方法分别制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)(Oka株)毒种,比较两种方法制备的毒种对2BS细胞的感染复数及增殖动态差异.方法 用现有方法(用含2％小牛血清的病毒维持液于-70℃条件下冻存Oka株毒种)和新方法(用含90％小牛血清的病毒冻存液于-196℃条件下冻存Oka株毒种)制备第47代Oka株VZV毒种,采用不同的MOI(0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1)感染第37代2BS细胞,观察细胞病变(CPE)情况,收获不同MOI接种和培养不同时间点病毒制备疫苗,采用噬斑法检测疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性,确定两种方法制备的毒种对2BS细胞感染的适MOI.结果 现有方法制备毒种以0.01 ～0.1 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期;新方法制备毒种以0.001 ～0.01 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期.两种方法收获的病毒液制备的成品疫苗的病毒滴度为4.4 ～4.6 lgPFU/ml,37℃放置1周,病毒滴度3.8～4.0 lgPFU/ml;疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性无差异,均达到本公司水痘减毒活疫苗制造与检定规程制定的相关标准.结论 现有方法和新方法制备的毒种适MOI分别为0.01～0.1和0.001～0.01,新方法制备的毒种更适合水痘疫苗的生产.
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带状疱疹疫苗生产中2BS细胞细胞工厂培养工艺的建立
目的 建立带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺.方法 将2BS细胞复苏(28代)后,连续传代至35、36代,再分别按1∶4、1∶2比例传至10层细胞工厂中,采用不同的加液量(200、300、400 ml/层)进行培养,显微镜下观察细胞形态,并进行细胞计数.取细胞工厂,按MOI 0.008接种水痘-带状疱疹病毒,制备成带状疱疹减毒活疫苗,检测疫苗原液及成品的滴度;疫苗成品进行37℃稳定性试验;采用酶联免疫法检测抗生素残留量和牛血清白蛋白残留量;凝胶法检测内毒素含量;水分容量滴定法检测水分含量.结果 2BS细胞按1∶2比例传代,细胞工厂单层加液量为300 ml,可制备单层致密、优质的细胞,细胞工厂收获时细胞病变达80％以上,且病变细胞圆润、典型、广泛,细胞形态保持较好;传代比例为1∶4的细胞制备的疫苗原液及成品的滴度明显低于传代比例为1∶2的细胞制备的疫苗,且1∶4传代的细胞制备的疫苗成品37℃豫定性滴度不符合带状疱疹疫苗放置1周病毒滴度不小于4.6 lgPFU/ml的质量标准;其他各项质量指标均符合要求.结论 建立了带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺,利用细胞工厂可制备出质量均一、致密优质的2BS细胞.
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细胞工厂在麻腮风系列疫苗生产中的应用
目的 利用细胞工厂培养麻疹、腮腺炎和风疹病毒,并制备麻腮风各单价及联合疫苗.方法 应用40层细胞工厂培养原代鸡胚细胞和2BS细胞,制备麻疹、腮腺炎和风疹病毒原液(同时以15 L转瓶培养工艺作为对照),并制备麻腮风各单价及联合疫苗,按照《中国药典》三部(2015版)方法进行病毒滴度检测.结果 细胞工厂制备的麻疹、腮腺炎和风疹病毒原液滴度分别为大于5.2、6.1和5.7 lgCCID50/mL,高于转瓶工艺,且符合《中国药典》三部(2015版)相关规定;1个40层细胞工厂制备的病毒原液量相当于1个转瓶的4至8倍,产量较高.细胞工厂制备的多批次麻腮风各单价及联合疫苗的病毒滴度均符合《中国药典》三部(2015版)相关标准,且病毒滴度热稳定性下降均不超过1个lg.结论 利用细胞工厂制备麻腮风各单价及联合疫苗的工艺稳定,重复性好,质量可控,可用于规模化生产.
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中药山桔颗粒抑制人巨细胞病毒感染的体外实验研究
本研究借助体外细胞培养技术观察不同浓度的山桔颗粒药物在2BS细胞培养内对人巨细胞病毒(HCMV)的抑制作用,实验采用细胞病变效应(CPE)法,计算山桔颗粒药物的半数有效浓度(IC50)和小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI),半数中毒浓度(TD50)和大无毒浓度(TD0),结果表明山桔颗粒在体外能够有效地抑制HCMV导致的细胞病变,具有抗HCMV作用.
关键词： 2BS细胞 山桔颗粒 人巨细胞病毒(HCMV) 体外实验 -
刺五加对人胚肺二倍体纤维母细胞生长的影响
目的:探讨刺五加(APS)对人胚肺二倍体纤维母细胞(2BS)增殖、凋亡的影响.方法:采用生物活性法观察不同浓度APS在不同时间对2BS细胞增殖的抑制作用,利用流式细胞仪检测其诱导2BS细胞凋亡小体形成百分率及对细胞周期的影响,并与甲基强的松龙(M-pred)比较.结果:①APS和M-pred对2BS细胞均有增殖抑制作用,与无药空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),但两药作用相比差异无统计学意义(P>0.05);②APS和M-pred均有诱导2BS细胞凋亡作用,主要作用于S期,2BS细胞凋亡小体形成百分率与无药空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01),但两药作用相比差异无统计学意义(P>0.05).结论:APS有显著抑制2BS细胞增殖并诱导其凋亡的作用、活性与M-pred相近,但由于APS尚有多种药理作用而无不良副反应,所以是治疗肺纤维化较好的药物.
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衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3的表达
目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)表达增加的影响因素.方法:用Northern blot的方法显示IGFBP-3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异;PCR扩增出人类IGFBP-3上游包括5′-UTR区的2 kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP-3启动子片段;将各片段用Effectene Transfection Reagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件.结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中IGFBP-3基因的表达升高;在IGFBP-3启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点;5′-ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc-3′是IGFBP-3的增强子元件.结论:在衰老的2BS细胞中IGFBP-3基因上游-37到-8的30 bp序列存在一个新的增强子元件IEE (IGFBP-3 enhancer element),对IGFBP-3的表达起到调控作用.
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病毒感染复数对狂犬病毒PM株增殖的影响
目的：探讨不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的狂犬病毒PM株在人二倍体细胞(2BS株)中增殖的影响,确定感染复数。方法将狂犬病毒PM株按照MOI 0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20接种至2BS细胞中,用显微镜观察接种病毒后细胞的形态变化；培养3~5d后,第一次收获病毒液；更换培养液继续培养3~4d后,进行第二次收获。采用小鼠脑内滴定法测定狂犬病毒滴度,通过NIH法测定灭活病毒液的效价。结果当MOI为0.05~0.10时,细胞圆缩30%~40%,细胞能维持较好的生长形态,可收获病毒,病毒收获液的滴度较高(>5.0 lgLD50/mL),且灭活后病毒液的效价较高(>4.0IU/mL)。结论确定狂犬病毒PM株在人二倍体2BS细胞增殖的适宜MOI,为人用狂犬病疫苗生产工艺的优化提供了依据。
