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Nogo-66多克隆抗体的制备和鉴定
目的制备抗中枢神经系统(CNS)突起再生抑制因子Nogo胞外段Nogo-66的多克隆抗体,以进行Nogo分子检测和功能研究.方法采用原核系统表达来源于大鼠的GST-Nogo-66融合蛋白,经纯化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体,采用免疫印迹、免疫组织化学和细胞培养技术对该抗体的特异性及生物学活性进行鉴定.结果获得了高效价的1∶ 10 000兔抗大鼠Nogo-66多克隆抗体,该抗体能够识别原核表达的Nogo分子,大鼠脊髓切片的免疫组织化学结果显示,Nogo分子在神经元和少突胶质细胞中有广泛表达;并能阻断Nogo分子对PC12细胞突起生长的抑制作用,具有一定的生物学活性.结论制备了能识别天然Nogo分子,并具有良好生物学活性的抗Nogo-66多克隆抗体,为检测Nogo分子和进一步研究其功能提供了有力的工具.
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Nogo-54m、Nogo-54及Nogo-66在中枢神经再生研究的新进展
目前对Nogo蛋白的中枢神经生长抑制作用及其机制的研究较多,国内外主要集中于对Nogo-66的研究,Nogo-66是Nogo蛋白中一段长66个氨基酸的多肽,与其特异性受体(NgR)结合具有介导抑制轴突再生的作用.近年设计出了与Nogo-66有相似特性的模仿物Nogo-54及其拮抗物Nogo-54m,对中枢神经再生研究具有重大意义,本文综述了Nogo-54,Nogo-54m,Nogo-66的结构及其功能
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Nogo-66抑制神经元神经突生长的研究
目的 观察在神经干细胞分化过程中Nogo-66对神经元神经突生长是否存在抑制作用.方法 体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,在神经干细胞分化过程中加入Nogo-66的活性片段Nogo-p4,NSE抗体免疫荧光标记神经元,使用Image-Pro Plus 5.0软件测量神经突长度.结果 对照组神经干细胞分化第3天神经元神经突长度为(97.80±6.97)μm/cell,加入Nogo-p4的实验组神经元神经突长度为(80.54±6.75)μm/cell.实验组和对照组神经元神经突长度差异有显著性,P＜0.01.实验组神经元神经突长度较对照组缩短约17%.结论 Nogo-66对神经干细胞分化过程中形成的神经元具有神经突生长抑制作用.
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Nogo-B的功能研究进展
Nogo基因是近些年来发现的新基因,目前发现Nogo基因编码的三种蛋白:Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C,均是中枢神经系统髓鞘中具有抑制神经生长活性的跨膜蛋白.以前的研究显示Nogo蛋白主要作为轴突再生抑制蛋白对中枢神经系统的再生有抑制功能.近年来,人们发现,Nogo-B的亚型在体内分布广泛,其功能不仅影响中枢神经系统再生,而且在肿瘤活动性、动脉粥样硬化、细胞凋亡、血管损伤后修复、主动脉瘤以及肾损伤、哮喘、肝硬化等疾病中都发挥一定的作用.
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Nogo-66融合蛋白的原核表达及鉴定
目的原核表达轴突再生抑制蛋白Nogo-66,并对其进行鉴定.方法采用聚合酶链反应方法从含Nogo-66编码序列的质粒DNA中扩增出Nogo-66基因开放阅读框,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定.结果测序鉴定Nogo-66开放阅读框成功插入pET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达大鼠Nogo-66蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量(Mr)约7 000,Western Blot结果证实表达产物融合有聚组氨酸标签.结论应用原核表达系统成功表达了Nogo-66蛋白,为下一步制备Nogo-66蛋白疫苗及疫苗功能研究打下了基础.
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RNA干扰沉默神经干细胞Nogo-66受体基因阻断Nogo-66抑制神经突生长作用的研究
目的 检测Nogo-66是否对大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成的神经元具有神经突生长抑制作用,以及其抑制作用是否可以通过沉默Nogo-66受体(Nogo-66 receptor,NgR)基因的方法进行阻断.方法 体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,经小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转染以沉默NgR基因表达,用免疫荧光法和Western blot检测神经干细胞在转染前后NgR基因的表达.取神经干细胞分为四组,均在含10%胎牛血清的培养基中分化.对照组不加干预因素;Nogo-P4组在分化过程中加入Nogo-66的活性片段Nogo-P4;siRNA组神经干细胞经siRNA转染使NgR基因表达沉默后开始分化;siRNA加Nogo-P4组神经干细胞经siRNA转染后在含有10%胎牛血清和Nogo-P4的培养基中分化.免疫荧光法标记分化形成的神经元,测量神经突长度,比较各组神经突长度的变化.结果 悬浮培养的细胞形成典型的神经球,经免疫荧光检测Nestin表达阳性.加入10%胎牛血清分化1周后,可观察到神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白质和髓鞘碱性蛋白标记阳性的细胞.siRNA转染后24 h,大部分神经干细胞NgR基因染色转为阴性,Western blot检测神经干细胞NgR基因表达显著降低,NgR基因阻断效率为90.35%±3.10%.神经干细胞分化第3天形成的神经元神经突长度在对照组为97.80±6.97 μm,Nogo-P4组为80.54±6.75 μm,siRNA组为92.14±7.27 μm,siRNA加Nogo-P4组为94.01±8.37 μm.Nogo-P4组与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.01),对照组、siRNA组和siRNA加Nogo-P4组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Nogo-66对神经干细胞分化形成的神经元有神经突生长抑制作用,可以通过RNA干扰技术使神经干细胞NgR基因表达沉默,并阻断Nogo-66抑制神经突生长的作用.
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Nogo-66拮抗性多肽的筛选及其对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响
目的:筛选与Nogo-66特异性结合的多肽,并进行初步功能检测.方法:采用了核糖体展示技术,即体外人工合成引物和含36个随机序列的寡核苷酸,通过两轮PCR构建随机DNA文库,然后在体外进行偶联的转录和翻译,得到含随机12肽的核糖体文库,并利用含随机12肽的核糖体文库对Nogo-66进行初步筛选.用ELISA方法检测筛选到的多肽与Nogo-66的亲和力.同时制备大鼠T10节段挫伤模型,损伤后1 d尾静脉注射筛选到的多肽(50 g/50 Ⅰ),HRP逆行染色观察脊髓轴突再生情况.并通过BBB评分观察大鼠神经功能恢复.结果:经过10轮筛选,得到了可与Nogo-66结合的氨基酸序列,合成相应的多肽NAPA,同时合成对照多肽NAPB.ELISA结果显示,NAPA与Nogo-66的亲和力明显高于NAPB与Nogo-66的亲和力(P<0.05).NAPA尾静脉注射4、6周时,实验组大鼠BBB评分明显高于对照组(P<0.05),HRP逆行示踪显示NAPA治疗组的脊髓髓鞘染色清晰,排列规则.结论:筛选得到的Nogo-66的配体多肽NAPA可以明显促进脊髓损伤动物的恢复及脊髓再生.多肽NAPA的筛选成功为脊髓损伤的修复提供新的治疗方法和药物选择.
